[發明專利]一種提高里氏木霉耐糠醛的方法

在審

• 申請號: 202010340890.6
• 申請日: 2020-04-26
• 公開（公告）號: CN111471703A
• 公開（公告）日: 2020-07-31
• 發明（設計）人: 賀建龍;吳真;徐寧;熊鵬;徐繼明
• 申請（專利權）人: 淮陰師范學院
• 主分類號: C12N15/80
• 分類號: C12N15/80;C12N15/90;C12N15/65;C12N15/53;C12N9/42;C12R1/885
• 代理公司: 淮安市科翔專利商標事務所 32110
• 代理人: 韓曉斌

1.一種提高里氏木霉耐糠醛的方法，其特征是該方法包括以下步驟：

(1)合成兩端含有限制性內切酶酶切位點序列的如下DNA片段：

DNA片段1：無縫克隆同源序列1-里氏木霉hup(編碼histone-fold-containingprotein)啟動子序列-潮霉素抗性基因hyg序列-里氏木霉hup終止子序列-里氏木霉gap(編碼glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)啟動子序列-乙醛脫氫酶序列-里氏木霉gap終止子序列-無縫克隆同源序列2；

DNA片段2：無縫克隆同源序列1-pCAMBIA1300質粒骨架序列-無縫克隆同源序列2；

其中，里氏木霉hup啟動子序列如SEQ ID NO.1所示，潮霉素抗性基因hyg序列如SEQ IDNO.2所示，里氏木霉hup終止子序列如SEQ ID NO.3所示，里氏木霉gap啟動子序列如SEQ IDNO.4所示，乙醛脫氫酶序列如SEQ ID NO.5所示，里氏木霉gap終止子序列如SEQ ID NO.6所示；

(2)將步驟(1)中的2個DNA片段通過無縫克隆連接成重組載體pCAMBIA1300-ALD；

(3)用重組載體pCAMBIA1300-ALD轉化里氏木霉，以潮霉素抗性作為篩選標記，篩選得到重組成功的含有乙醛脫氫酶的里氏木霉菌株若干；

(4)將篩選到的重組里氏木霉菌進行耐糠醛產纖維素酶驗證，最終得到耐糠醛產纖維素酶的重組里氏木霉菌株。

2.根據權利要求1所述的一種提高里氏木霉耐糠醛的方法，其特征是所述方法包括以下具體步驟：

一、重組質粒pCAMBIA1300-ALD的構建

(1)質粒pCAMBIA1300的提取

含有pCAMBIA1300的大腸桿菌DH5α接種到含有卡那霉素的LB培養基(LB培養基：氯化鈉1％，蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，121℃滅菌20min，加入經過無菌0.22μm孔徑過濾的卡那霉素，卡那霉素在LB中的終濃度為50μg/mL)中，37℃培養過夜；使用質粒小量抽提試劑盒(碧云天，D0003)按照說明書說明提取pCAMBIA1300質粒，提取步驟如下：

1).取過夜培養菌液1.5毫升，5000g離心1分鐘收集細菌沉淀，棄上清；再重復一次，每管共收集3毫升過夜菌沉淀；

2).每管加入250微升提取試劑盒里的溶液I(已經添加了RNase A)，重懸細菌沉淀；確保沉淀完全散開，無可見細菌團塊；

3).每管加入250微升提取試劑盒里的溶液II，輕輕顛倒離心管4-6次，使細菌完全裂解，溶液透明；

4).每管加入350微升提取試劑盒里的溶液III，隨即顛倒離心管4-6次混勻，可見白色絮狀物產生；

5).最高速(13,000rpm左右)室溫離心10分鐘；

6).將上一步離心后的上清倒入或吸入到質粒純化柱內；最高速離心30-60秒，倒棄收集管內液體；

7).在質粒純化柱內加入750微升提取試劑盒里的溶液IV，最高速離心30-60秒，洗去雜質，倒棄收集管內液體；

8).再最高速離心1分鐘，除去殘留液體并使痕量乙醇完全揮發；

9).將質粒純化柱置于潔凈1.5毫升離心管上，加入50微升提取試劑盒里的溶液V至管內柱面上，放置1分鐘；

10).最高速離心1分鐘，所得液體即為質粒pCAMBIA1300；

(2)DNA片段2的獲得

以獲得的質粒pCAMBIA1300做為模板，引物序列gacttcggcgggagccgcagaggatatattggcgggtaaa和aatactttggtggcgtcgattgttattaagttgtctaagc，用BeyoFusion^TMDNAPolymerase(碧云天)進行pcr擴增獲得，具體參數如下：

1)pcr反應體系設置

2)pcr反應參數設置

STEP1(起始變性)	92℃3min
STEP2(變性)	92℃30sec
STEP3(退火)	55℃30sec
STEP4(延伸)	68℃1min/kb
STEP5(循環)	Go To STEP2 for 30 cycles
STEP6(最終延伸)	68℃15min
STEP7(臨時保存)	4℃forever

(3)膠回收DNA片段2

使用DNA凝膠回收試劑盒(碧云天，D0056)回收步驟二中pcr擴增獲得的DNA片段2，步驟如下：

1).切膠回收后，稱重，將膠切碎或在離心管內用1ml槍頭搗碎；

2).加入等體積的提取試劑盒里的溶液I(每100mg膠加100微升溶液I)，vortex或顛倒混勻；

3).50-60℃水浴加熱約10分鐘至膠全融，期間，需vortex或顛倒混勻3-4次，以加速凝膠融解；

4).加入到DNA純化柱內，室溫放置1分鐘；

5).最高速(16000g，約12000-14000rmp左右)離心1分鐘，倒棄收集管內的液體；

6).在DNA純化柱內加入700微升提取試劑盒里的溶液II，室溫放置1分鐘；

7).最高速離心1分鐘，洗去雜質；倒棄收集管內的液體；

8).再加入500微升提取試劑盒里的溶液II，最高速離心1分鐘，進一步洗去雜質；倒棄收集管內的液體；

9).最高速再離心1分鐘，除去殘留液體并讓殘留的乙醇充分揮發；

10).將DNA純化柱置于1.5毫升離心管上，加入30微升溶液III至管內柱面上，放置1分鐘；

11).最高速離心1分鐘，所得液體即為高純度DNA片段2；

(4)DNA片段1和DNA片段2連接成重組質粒pCAMBIA1300-ALD

使用Seamless Cloning Kit無縫克隆試劑盒(碧云天，D7010S)進行質粒連接；

100ng合成的DNA片段1、50ng切膠回收的DNA片段2、2X Seamless Cloning Mix 10μL冰上混勻后，加Milli-Q水至總體積20uL于50度孵育15分鐘；

(5)大腸桿菌的轉化和篩選

1)取5μl上步驟(4)的反應樣品加入到50-100μL DH5α感受態細胞中，輕輕混勻，將該混合物置于冰上30min；

2)42℃水浴中90秒進行熱激，然后迅速放回冰浴中，靜置3～5min；

3)加入500μL不含抗生素的LB培養液，輕輕混勻，37℃震蕩培養1h；

4)將菌液5000rpm離心1min以沉淀菌體；吸去大部分培養液，剩余約50-100μL的培養液，重懸菌體；然后全部均勻涂布到含卡那霉素的LB平板上，37℃培養箱中培養過夜；

5)第二天挑取平板上的克隆進行菌落PCR和提取質粒進行酶切鑒定后，進行測序鑒定，驗證正確的重組質粒即為pCAMBIA1300-ALD；

二、農桿菌介導轉化里氏木霉

(1)農桿菌感受態細胞的制備

1)在新活化的農桿菌EHA105的LB平板上，挑取單克隆于LB液體培養基；

2)28℃、220rpm振蕩培養至OD600達到0.6-0.7；

3)取1.5mL無菌離心管，每管分裝1mL菌液，3000g離心5min；

4)去除上清，用1mL 10％無菌甘油重懸菌體，3000g離心5min，重復此過程2次，充分洗滌菌體以去除殘留的培養基；

5)洗好的菌體用100μL 10％無菌甘油重懸，-70℃保存備用；

(2)質粒pCAMBIA1300-ALD轉化農桿菌

1)將100μL農桿菌EHA105感受態細胞置于冰上溶解成液態后，加入10μL pCAMBIA1300-ALD，充分混勻，冰上放置30min；

2)將混懸液放入電轉杯中2.5kv/cm電擊；

3)把電擊液轉至1.5mL LB液體培養基于28℃、220rpm培養2h；

4)吸取100μL菌液涂布含卡那霉素50μg/mL的LB平板，28℃、220rpm培養48h；

5)挑取單菌落進行菌落pcr鑒定，驗證正確的菌落接種到含卡那霉素的LB液體培養基中，28℃、220rpm培養48h，得到含有質粒pCAMBIA1300-ALD的農桿菌用于共培養用；

(3)里氏木霉孢子制備

1)從-80℃冰箱取出甘油管保藏的里氏木霉RUT C-30，置于室溫下解凍；

2)吸取適量菌液加到PDA培養基平板上，用涂布棒將菌液涂布均勻，30℃恒溫培養7天；

3)平板上長出一層綠色的孢子后，用生理鹽水洗下孢子，用IM液稀釋至10⁷/mL待轉化用；

(4)含有質粒pCAMBIA1300-ALD的農桿菌轉化里氏木霉

1)將含有質粒pCAMBIA1300-ALD的農桿菌用IM液(含200uM AS)于28℃150rpm誘導6h；

2)1：1體積與里氏木霉孢子液混合后涂布于含玻璃紙的IM(含200uM AS)固體培養基，25℃培養48h。

3)將玻璃紙轉移至含抗生素(150mg/L潮霉素和50mg/L羧芐青霉素)的MM固體平板上，培養約48h；

4)將玻璃紙揭去繼續培養到菌落出現后挑取菌落分離純化后，提取基因進行pcr驗證，驗證正確的即為轉化成功的里氏木霉重組菌。