[發(fā)明專利]一種產(chǎn)酯酶自誘導(dǎo)培養(yǎng)基及其應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010338502.0
• 申請(qǐng)日: 2020-04-26
• 公開（公告）號(hào): CN111549014A
• 公開（公告）日: 2020-08-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 徐毅;沈海云;魏凱欣;馬寶娣;吳小梅;劉勝利
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N9/18
• 分類號(hào): C12N9/18;C12N1/21;C12N1/20;C12R1/19
• 代理公司: 上海科盛知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31225
• 代理人: 趙志遠(yuǎn)

本發(fā)明涉及一種產(chǎn)酯酶自誘導(dǎo)培養(yǎng)基，配方為：甘油5～13g/L，葡萄糖0.3～1.3g/L，乳糖1～6g/L，胰蛋白胨10～30g/L，酵母浸粉3～13g/L，0.0～0.5g/L MgSO₄，17～19g/L Na₂HPO₄，6～8g/L KH₂PO₄，2～3g/L NH₄Cl，0.5～1.0g/L Na₂SO₄，痕量元素適量。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明培養(yǎng)基組分及培養(yǎng)條件出發(fā)，找到一條既能高效表達(dá)外源蛋白，又能實(shí)現(xiàn)自動(dòng)誘導(dǎo)的改進(jìn)型產(chǎn)酯酶大腸桿菌自誘導(dǎo)培養(yǎng)基，利用改進(jìn)型自誘導(dǎo)培養(yǎng)基，并采用雙溫度調(diào)控方式，對(duì)重組大腸桿菌E.coli BL21(DE3)/pET?21a?estsit01進(jìn)行培養(yǎng)和發(fā)酵產(chǎn)酶；本發(fā)明的自誘導(dǎo)培養(yǎng)基利用乳糖作為底物誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)，具有產(chǎn)酶量高，成本低；重組酯酶細(xì)胞的酶活可以達(dá)到1684U/L的優(yōu)點(diǎn)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種生物工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種改進(jìn)型的重組大腸桿菌工程菌自誘導(dǎo)培養(yǎng)基及其在產(chǎn)酯酶發(fā)酵中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

酯酶(Esterase,EC 3.1.1.1)是一類具有水解酯鍵能力的酶。酯鍵在羧酸酯酶的催化下進(jìn)行斷裂，產(chǎn)生甘油和脂肪酸，合成時(shí)能把酸的羧基與醇的羥基脫水縮合，形成酯類及其他芳香類物質(zhì)，且在催化反應(yīng)過程中不需要任何輔酶的協(xié)助。

酯酶的來源廣泛，存在于動(dòng)物、植物和微生物中。其中來源于微生物的酯酶具有廣泛的pH值、耐受的溫度、對(duì)于底物具有高的區(qū)域選擇性和專一性，被廣泛應(yīng)用于食品加工、農(nóng)業(yè)、制藥行業(yè)及化工、環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域。

D-生物素屬于B族維生素，又稱Vitamin B7或Vitamin H。市場(chǎng)上可作為醫(yī)藥產(chǎn)品和飼料添加劑。對(duì)生命有機(jī)體也具有重要的作用，人體若缺乏生物素則會(huì)引起皮炎、食欲不振、脫發(fā)、貧血和精神抑郁病癥等營(yíng)養(yǎng)性疾病。

(3aS,6aR)-內(nèi)酯是生物素合成的重要關(guān)鍵中間體。1970年Gerecke發(fā)現(xiàn)可以通過內(nèi)酯的方法進(jìn)一步提高生物素的合成產(chǎn)率(Gerecke M.Helvetica Chimica Acta,1970,53(5):991-999)。2003年陳芬兒通過化學(xué)法以內(nèi)消旋酸酐不對(duì)成水解生成(4S,5R)-單甲酯，進(jìn)而還原得到(3aS,6aR)-內(nèi)酯，但是因?yàn)榉磻?yīng)需要低溫、且反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)，所以限制了此種方法的應(yīng)用。生物法與化學(xué)法相比具有反應(yīng)步驟簡(jiǎn)單、反應(yīng)條件溫和、專一性催化且效率高等優(yōu)勢(shì)而逐漸被廣泛應(yīng)用。2010年，徐毅等人篩選出一株巧克力微桿菌(Microbacteriumchocolatum SIT101)，該菌株所產(chǎn)的酯酶能夠高選擇性催化內(nèi)消旋生物素二甲酯不對(duì)稱水解生成(4S,5R)-半甲酯，產(chǎn)率為95％，e.e值大于99％(徐毅等.一種巧克力微桿菌及制備(4S,5R)-半酯的方法[P].中國(guó)專利.CN102120977A,2010)。并且在大腸桿菌中對(duì)該菌株來源的酯酶進(jìn)行異源表達(dá)，構(gòu)建了大腸桿菌基因工程菌E.coli BL21(DE3)-pET21a-estsit01，同時(shí)在搖瓶水平上優(yōu)化了在誘導(dǎo)劑IPTG誘導(dǎo)下細(xì)胞發(fā)酵酶活為1072U/L。

在基因工程菌中表達(dá)外源目的蛋白，常選用基于強(qiáng)啟動(dòng)子T7的表達(dá)系統(tǒng)。在T7啟動(dòng)子有效地表達(dá)目標(biāo)蛋白的時(shí)候常常會(huì)使用IPTG的誘導(dǎo)，操作比較繁瑣。并且IPTG價(jià)格昂貴，對(duì)細(xì)菌潛在一定的毒性，直接影響蛋白的表達(dá)率。經(jīng)研究表明，非目的性表達(dá)出來的目的蛋白可能也會(huì)導(dǎo)致目的蛋白的不穩(wěn)定性。

利用自誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)菌使之表達(dá)外源蛋白的方法能夠很好的解決上述的技術(shù)問題。自誘導(dǎo)(auto-induction)是在2005年間Studier等人提出的一種利用培養(yǎng)基中碳源轉(zhuǎn)換而誘導(dǎo)外源基因表達(dá)的方法(STUDIER F W.Protein Expr purif.2005,41(1):207-234.)。其首先是以葡萄糖作為速效碳源進(jìn)行消耗，待大腸桿菌生長(zhǎng)至飽和，葡萄糖消耗殆盡，培養(yǎng)基中的另一種碳源成分乳糖作為遲效碳源將被利用。甘油同樣作為碳源，在細(xì)胞生長(zhǎng)中后期階段提供能量。