[發明專利]一種利用熒光RPA鑒定白紋伊蚊的方法

有效

• 申請號: 202010327634.3
• 申請日: 2020-04-23
• 公開（公告）號: CN111534603B
• 公開（公告）日: 2022-07-26
• 發明（設計）人: 曹曉梅;張曉龍;李穎;楊燕;慈穎;劉瑩瑩;劉麗娟;王靜;楊宇
• 申請（專利權）人: 中國檢驗檢疫科學研究院
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 北京慕達星云知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11465
• 代理人: 王敏

本發明公開了一種利用熒光RPA鑒定白紋伊蚊的方法，屬于生物技術領域。本發明公開的一種利用熒光RPA鑒定白紋伊蚊的方法，設計了白紋伊蚊檢測特異性引物和探針，建立了檢測白紋伊蚊的熒光RPA方法，在39℃，20min即可完成檢測；操作簡便，靈敏度高，特異性強，重復性好。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，更具體的說是涉及一種利用熒光RPA鑒定白紋伊蚊的方法。

背景技術

白紋伊蚊（Aedes albopictus），也被稱為亞洲虎蚊，屬于雙翅目蚊科，源于東南亞，是東南亞和中國的常見蚊種。白紋伊蚊既是一種攻擊性很強的蚊子，也是一種重要的病毒媒介，它可以傳播很多病原體，包括登革熱、羅斯河病毒和西尼羅病毒。白紋伊蚊是“半家蚊”，喜歡孳生在小型的積水容器中；家居周圍廢棄的缸、罐、桶、鍋、泡菜壇、盆景、蓮花缸、罐頭盒、碗、杯等積水中；室內的插花瓶、水缸、痰桶和花盆托等積水；植物的莖葉等小型積水，如竹筒、葉腋、椰子殼、芭蕉葉、香蕉葉等積水中；白紋伊蚊除孳生在人居周圍外，在遠離人居的竹林的竹桶、樹洞、石穴等積水容器中，也可孳生大量白紋伊蚊。

重組酶聚合酶擴增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA）技術是一種新型的在恒溫下可以使核酸快速擴增的方法。該技術在恒溫下，利用重組酶可與引物DNA緊密結合，形成酶和引物的復合體，當引物在模板DNA上搜索到與之完全互補的序列時，在單鏈DNA結合蛋白（single stranded DNA binding，SSB）的幫助下，使模板DNA解鏈，并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互補鏈。反應產物呈指數級增長，整個反應過程無需特殊的輔助儀器，操作簡便。

因此，提供一種利用熒光RPA鑒定白紋伊蚊的方法是本領域技術人員亟需解決的問題。

發明內容

有鑒于此，本發明提供了一種利用熒光RPA鑒定白紋伊蚊的方法，操作簡便，靈敏度高，特異性強，重復性好。

為了實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種利用熒光RPA鑒定白紋伊蚊的引物探針組合物，所述引物序列如下：

上游引物：5’-GTCGTGGTTGATGAGTACATCCCAAACCGGAGT-3’；SEQ ID NO.3；

下游引物：5’-GAGCCCACTGAGAGTTCCAGGTGACTGTTCC-3’；SEQ ID NO.4；

所述探針序列如下：

5’-CCCGTGTGTGAGTTGTGCGGTGCGGTGTCG[FAM-dT]GG[THF]A[BHQ1-dT]TAGGCGCGTGCGCG-3’-PHO。

進一步，含有上述引物探針組合物的試劑盒。

進一步，一種利用熒光RPA鑒定白紋伊蚊的方法，步驟如下：

（1）提取樣品DNA；

（2）以樣品DNA為模板，利用上述的引物探針組合進行擴增；在39℃條件下反應20min。

經由上述的技術方案可知，與現有技術相比，本發明公開提供了一種利用熒光RPA鑒定白紋伊蚊的方法，設計了白紋伊蚊檢測特異性引物和探針，建立了檢測白紋伊蚊的熒光RPA方法，在39℃，20 min即可完成檢測。對目的DNA的檢測限為0.01ng/μL，3個平行的差異系數值均≤4.85%，顯示了良好的重復性。本發明還用相同的引物，采用RPA Basic方法進行了檢測，在33℃，25min可完成檢測，并經測序、BLAST結果顯示均為白紋伊蚊ITS2序列，進一步驗證了熒光RPA方法的檢測結果，并且與基于DNA條形碼的方法檢測結果一致。熒光RPA方法和RPA Basic的方法相比，省去了DNA純化和凝膠電泳的繁瑣步驟而更加簡便。

附圖說明