[發明專利]一種固定化酶連續制備[14/15

有效

• 申請號: 202010327490.1
• 申請日: 2020-04-23
• 公開（公告）號: CN111518851B
• 公開（公告）日: 2023-05-23
• 發明（設計）人: 黃鋼;李斌
• 申請（專利權）人: 上海健康醫學院
• 主分類號: C12P13/10
• 分類號: C12P13/10;C12N15/77;C12N15/66
• 代理公司: 廣東德而賽律師事務所 44322
• 代理人: 葉秀進

本申請公開了一種固定化酶連續制備[^14/15N]?L?瓜氨酸的方法，屬于酶學與酶工程技術領域。其方法是將包含固定化酶的融合蛋白懸浮于填充床反應器；再將包含[^14/15N]?L?精氨酸的溶液在20?55℃條件下，以流速0.3?0.5BV/h流經填充床反應器進行反應，反應液經分離、純化即可得到[14/15N]?L?瓜氨酸。本發明的技術構思是采用cipA固定化融合蛋白為載體將精氨酸脫亞胺酶arc固定于包涵體蛋白cipA上，產生具有催化活性的包涵體蛋白cipA?arc，即cipA?arc融合蛋白。本申請提供的具有催化活性的固定化cipA?精氨酸脫亞胺酶cipA?arc融合蛋白，能連續反應560小時以上；同時得到的具有同位素標記的[^14/15N]L?瓜氨酸，為前列腺疾病、心血管疾病等的診斷與治療提供了有效途徑。

技術領域

本申請涉及一種生產高純度[^14/15N]-L-瓜氨酸的方法，尤其是一種利用重組精氨酸脫亞胺酶分解[^14/15N]-L-精氨酸生產高純度[^14/15N]-L-瓜氨酸的方法，屬于酶學與酶工程技術領域。

背景技術

L-瓜氨酸(L-citrulline)是一種特殊氨基酸。參與體內多種代謝過程，如清除自由基，異體排斥效應指示劑，血管舒張作用，穩定血壓以及診斷類風濕關節炎，抗氧化等，防止前列腺疾病和提高性功能，抗衰老以及增強免疫力等，應用前景十分廣闊。

生產L-瓜氨酸的方法有：化學法、發酵法、酶法。化學法是指在堿性條件下水解L-精氨酸得L-瓜氨酸，水解過程控制比較困難，產品中含有旋光對映體D-瓜氨酸，影響產品質量，而且生產過程中產生大量廢水，污染環境；發酵法生產的難點在于單位體積L-瓜氨酸產率低，從發酵液中提取L-瓜氨酸操作工藝復雜，收率低，成本高；酶法生產是指在精氨酸脫亞胺酶的作用下，L-精氨酸被轉化為L-瓜氨酸，該法具有專一性強，產品濃度高的優點，但這種方法也存在催化劑利用率不高，即每一次生產后都得重新發酵制備菌體，這不但需要消耗大量的原料，而且會產生大量的廢水，增加環保處理成本；以及由酶催化劑帶入反應體系的雜質(大量的菌體、蛋白和發酵液殘留的各種金屬離子等雜質)，導致在L-瓜氨酸后處理過程中，產物分離純化要經過一系列的除菌體、除蛋白和離交柱等工藝步驟，進一步增加生產成本。

由于化學法、發酵法或酶法生產L-瓜氨酸均有許多缺點，導致生產成本高居不下，給實際推廣應用帶來了很大困難。

為了克服這些問題，提出了固定化酶或細胞的解決方案，固定化酶或細胞的制備方法有物理法和化學法兩大類。物理方法包括物理吸附法、包埋法等。物理法固定酶的優點在于酶不參加化學反應，整體結構保持不變，酶的催化活性得到很好保留。但是,由于包埋物或半透膜具有一定的空間或立體阻礙作用,因此對一些反應不適用?；瘜W法包括結合法、交聯法?；瘜W法酶與載體之間結合緊密，不易脫落，穩定性好，但反應條件激烈，操作復雜，控制條件苛刻，活力損失較大。

2008年鄭璞(鄭璞，倪曄，張文.填充床反應器中固定化假單胞菌細胞連續制備L-瓜氨酸[J].食品與生物技術學報，2008，27(5)：1673-1689)等報道了填充床反應器中固定化假單胞菌細胞連續制備L-瓜氨酸可在0.0108g·(h.g)^-1(每小時每克細胞產生的瓜氨酸克數)條件下進行連續54d運轉，但是菌體發酵生產過程復雜，而且固定化細胞時間過長，底物濃度低，產量不高，固定化細胞雖然簡單，但仍然存在胞體破碎釋放菌體中的雜蛋白及其它有機物質的問題，增加了反應體系中產物的分離純化的難度，而且細胞固定化也增加操作的步驟，增大了生產成本。

發明內容

根據本申請的第一方面，提供了一種固定化酶連續制備[^14/15N]-L-瓜氨酸的方法，所述方法包括如下步驟：

(1)將包含固定化酶的融合蛋白懸浮于填充床反應器；