[發明專利]3-甾酮-1,2-脫氫酶及其基因序列和應用

有效

• 申請號: 202010324122.1
• 申請日: 2020-04-22
• 公開（公告）號: CN111500600B
• 公開（公告）日: 2021-11-19
• 發明（設計）人: 蘇正定;成細瑤;宋士奎;周曦
• 申請（專利權）人: 武漢艾默佳華生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N9/02;C12P33/02
• 代理公司: 北京久維律師事務所 11582
• 代理人: 杜權

本發明提供了3?甾酮?1,2?脫氫酶及其基因序列和應用。一種用于表達3?甾酮?1,2?脫氫酶的基因序列，基因序列為SEQ ID.4，所述基因序列用于在大腸桿菌中表達。本發明的3?甾酮?1,2?脫氫酶能夠高效催化雄甾?4?烯?3,17?二酮(4?AD)反應生成雄甾?1,4?二烯?3,17?二酮(ADD)，具有高酶活性。另外，本發明獲得了可溶性的3?甾酮?1,2?脫氫酶，增加了酶的溶解度。

技術領域

本發明涉及生化領域，具體地，涉及3-甾酮-1,2-脫氫酶及其基因序列和應用。

背景技術

當甾體類化合物導入雙鍵后，如在抗炎甾體激素藥物母核的C1,2位導入雙鍵后，能成倍地增加其抗炎作用，如醋酸可的松C1,2位上導入雙鍵后行成的醋酸脫氫可的松，其抗炎作用提高了3-4倍，并且減少了由鈉滯留而帶來的副作用；還有許多臨床上常用的重要甾體化合物的生產，特別是大多數具有抗炎能力的腎上腺皮質激素的生產均涉及到微生物C1,2位的脫氫反應，包括氫化潑尼松(prednisolone)、地塞米松(dexamethasone)、帕拉米松(paramethasone)、倍他米松(batemethasone)、氟可龍(fluocortolone)、氟輕松(fluocinolone)、曲安西龍(triamcinolone)、甲基強的松龍(medrol)等。

傳統的方法是應用化學法進行C1,2脫氫。盡管化學方法已用于Δ1-脫氫，將不飽和度引入醋酸氫化可的松(HA)的1,2-位時，醋酸潑尼松龍(PA)的抗炎活性提高了三到四倍。然而，由于類固醇結構的復雜性，傳統的化學方法難以專一修飾甾體中間體，反應產率為80％左右，反應專一性低，副產物多，環境污染等缺陷，而且底物與產物往往結構相似不易分離等問題，使得高端甾體藥物工業生產化受到限制。從4-AD轉化而來的ADD是合成類固醇藥物的重要前體，例如避孕藥、雌激素和孕激素。利用4-AD制備ADD就一直是甾體醫藥行業的關鍵技術。高效酶法工藝制備甾體中間體，與激素藥物的多步化學合成相比，效率高，產物純度高。因此，酶促轉化由于其溫和的反應條件，高效率和特異性(區域選擇性和立體選擇性)而引起了廣泛關注。

利用3-甾酮-1,2-脫氫酶(KsdD)進行酶促反應制備ADD和其它C1,2-脫氫甾體藥物具有重大的應用前景。KsdD作為甾醇轉化過程中的關鍵酶，對整個甾醇轉化過程都起著很重要的作用。KsdD是一種黃素蛋白依賴型的脫氫酶，在催化反應過程中以黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)為輔因子，可以催化3-甾酮類固醇母核A環1,2位的碳碳單鍵(C-C)脫氫變成碳碳雙鍵(C＝C)。如下所示，KsdD催化雄烯二酮(4-AD)的C1,2位脫氫反應生成1，4-雄烯二酮(ADD)。KsdD酶已經在很多降解甾醇的細菌中被發現，如簡單節桿菌、紫紅紅球菌、睪丸酮假單胞菌、珊瑚諾卡氏菌、恥垢分支桿菌。由于不同來源KsdD酶，他們它們的氨基酸序列不同，蛋白酶構象存在差異性，導致底物的專一性也不同。