[發明專利]L-蘇氨酸醛縮酶突變體R318L及其應用

有效

• 申請號: 202010323801.7
• 申請日: 2020-04-22
• 公開（公告）號: CN111394343B
• 公開（公告）日: 2022-09-20
• 發明（設計）人: 王伯初;趙文艷;潘銀平;楊碧玲;祝連彩;戚娜
• 申請（專利權）人: 重慶大學
• 主分類號: C12N9/88
• 分類號: C12N9/88;C12N15/60;C12N15/70;C12N1/21;C12P13/22;C12R1/19
• 代理公司: 北京海虹嘉誠知識產權代理有限公司 11129
• 代理人: 呂小琴

本發明涉及蘇氨酸醛縮酶，具體涉及一種L?蘇氨酸醛縮酶突變體R318L及其應用。所述L?蘇氨酸醛縮酶突變體的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，是氨基酸序列為SEQ ID NO:1的L?蘇氨酸醛縮酶的第318位氨基酸由Arg變為Leu所得。該突變體在催化3,4?二羥基苯甲醛和甘氨酸合成屈昔多巴[L?蘇式?(3，4?二羥基)苯基絲氨酸]的反應中具有84.9％的非對映選擇性，是野生型的2.8倍，在屈昔多巴的生物合成中具有巨大的應用潛力。

技術領域

本發明涉及蘇氨酸醛縮酶，具體涉及一種L-蘇氨酸醛縮酶突變體R318L及其應用。

背景技術

屈昔多巴(L-threo-DOPS，即L-蘇式-(3，4-二羥基)苯基絲氨酸)是一種新的抗帕金森氏病藥物，用于改善由帕金森病引起的步態僵直和直立性頭暈；改善由Shy-Drager綜合征或家族性淀粉樣神經病所致的直立性低血壓、直立性頭暈和昏厥；改善血液透析患者由于直立性低血壓引發的頭暈和乏力。

目前，屈昔多巴的合成方法主要包括化學合成和酶催化法。其中，化學合成法主要是通過加成反應，酯化反應和化學拆分來得到手性的屈昔多巴，雖然操作簡單，但是反應過程中用到了大量的水、重金屬和劇毒的硫化氫，并且有大量的光學異構體作為副產物，不符合目前和將來國家提倡和推進的原子經濟學和環境保護政策。而酶催化法具有條件溫和、用水量少(僅為化學法的十分之一)、沒有重金屬污染、不使用劇毒化學品、手性選擇高等諸多優點，具有很好的應用前景。

蘇氨酸醛縮酶有著十分廣泛的應用潛力，它可以催化合成手性的醫藥關鍵中間體β-羥基-α-氨基酸。根據蘇氨酸醛縮酶對底物蘇氨酸α碳上的立體專一性可將該酶分為L型和D型兩類。申請號為2019109657806，發明名稱為“蘇氨酸醛縮酶、其編碼基因和在屈昔多巴生物合成中的應用”的專利申請公開了一種從黑熊糞便樣品中分離的L-蘇氨酸醛縮酶基因，全長1032bp，編碼由343個氨基酸組成的L-蘇氨酸醛縮酶。該酶以3-/4-位羥基取代的苯甲醛和甘氨酸為底物合成屈昔多巴(L-threo-DOPS)的非對映選擇性為30％。較低的非對映選擇性大大阻礙了該酶在L-threo-DOPS合成中的應用。因此，非常有必要挖掘具有高選擇性的蘇氨酸醛縮酶用于屈昔多巴的合成。

發明內容

為了開發具有高選擇性的蘇氨酸醛縮酶，本發明從一級結構至高級結構多角度多層系比較了從黑熊糞便樣品中分離的野生型L-蘇氨酸醛縮酶(氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示)與同源酶蛋白的異同，確定了影響野生型L-蘇氨酸醛縮酶學性質的位點為第318位氨基酸——精氨酸。然后通過密碼子替換將該位點的精氨酸(Arg)變為亮氨酸(Leu)，得到酶突變體，命名為L-TA R318L突變體。利用分子克隆技術獲得了L-TA R318L突變體的編碼基因(SEQ ID NO:4)，通過構建突變體基因的GST融合表達載體并導入基因工程菌E.coliBL21中誘導表達，獲得了L-TA R318L突變體酶蛋白。以L-TA R318L突變體為催化劑、3-/4-位羥基取代的苯甲醛為底物、甘氨酸為輔底物、5-磷酸吡哆醛為輔酶，在適當的條件和介質內進行酶催化反應，結果表明，該突變體合成屈昔多巴(L-threo-DOPS)的非對映選擇性高達84.9％，是其野生型酶的2.8倍，在屈昔多巴的工業生產中有巨大的應用價值。

本發明提供一種L-蘇氨酸醛縮酶突變體，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ IDNO:3所示，是氨基酸序列為SEQ ID NO:1的L-蘇氨酸醛縮酶的第318位氨基酸由Arg變為Leu所得。

編碼所述L-蘇氨酸醛縮酶突變體的基因也屬于本發明的保護范圍。

在本發明的一些優選實施例中，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

包含所述基因的表達盒、載體或重組菌也屬于本發明的保護范圍。