[發明專利]一種光響應型工程菌腸道靶向光遺傳載體系統及構建方法和應用

有效

• 申請號: 202010320056.0
• 申請日: 2020-04-22
• 公開（公告）號: CN111557918B
• 公開（公告）日: 2022-03-25
• 發明（設計）人: 王漢杰;崔梅慧;劉晶;孫韜;潘惠卓
• 申請（專利權）人: 天津大學
• 主分類號: A61K9/19
• 分類號: A61K9/19;A61K47/46;A61K38/18;A61K48/00;A61P1/00;C12N15/70;C12N15/65;C12N15/12;C12R1/19
• 代理公司: 天津盛理知識產權代理有限公司 12209
• 代理人: 韓曉梅

1.一種光響應型工程菌腸道靶向光遺傳載體，其特征在于：所述載體為藍光響應工程菌BL21@pH敏感微球載稀土納米材料@酸-堿-酶穩定的雙組分微球，該雙組分微球為均勻包裹殼聚糖的工程菌BL21@海藻酸鈉微球載稀土納米材料@酸-堿-酶穩定微球；

所述工程菌BL21@海藻酸鈉微球載稀土納米材料@酸-堿-酶穩定微球包括工程菌BL21pUC19-pDawn-Ag43-TGF-β1、稀土納米材料@酸-堿-酶穩定微球和海藻酸鈉；所述工程菌BL21@海藻酸鈉微球載稀土納米材料@酸-堿-酶穩定微球具有高效遞送工程菌BL21和稀土納米材料的雙組分遞送功能；

所述工程菌BL21 pUC19-pDawn-Ag43-TGF-β1包含光響應啟動子pDawn、黏附基因Ag43、工程菌表面展示因子TGF-β1；所述光響應啟動子pDawn、黏附基因Ag43具有光控定位功能，工程菌表面展示因子TGF-β1能夠與腸道黏膜系統共同承擔免疫協同功能；

所述稀土納米材料@酸-堿-酶穩定微球具有將近紅外光轉換成可視光源的功能；

所述近紅外光為980nm。

2.根據權利要求1所述的光響應型工程菌腸道靶向光遺傳載體，其特征在于：所述雙組分微球粒徑為400-1000μm，所述稀土納米材料@酸-堿-酶穩定微球粒徑為80-1000μm。

3.根據權利要求2所述的光響應型工程菌腸道靶向光遺傳載體，其特征在于：所述雙組分微球的粒徑通過調節微流控平臺中內外兩相流體的流速控制。

4.根據權利要求1至3任一項所述的光響應型工程菌腸道靶向光遺傳載體，其特征在于：所述載體為一種智能化、精準化、可視化和無創化的外源工程菌高效遞送，該載體利用光遺傳技術激活光響應外源工程菌，實現外源工程菌在宿主腸道病灶部位的靶向有效定植，進一步實現外源光響應工程菌發揮免疫調控的時空精準性。

5.如權利要求1至4任一項所述的載體的制備方法，其特征在于：具體方法如下：

⑴制備稀土納米材料@酸-堿-酶穩定微球：稱取稀土納米材料溶于預聚液中，稀土納米材料：預聚液的比例g：mL為0.1-0.5：1-5，預聚液的組成比例為：聚乙二醇二丙烯酸酯：聚乙二醇：2-羥基-2-甲基-1-苯基-1-丙酮的體積比為5：4-3：1-2，預聚液在制備時，直接將聚乙二醇二丙烯酸酯：聚乙二醇：2-羥基-2-甲基-1-苯基-1-丙酮按比例混勻即可；超聲分散，避光保存，作為內液；二甲基硅油作為外液；然后制備粒徑均一的稀土納米材料@酸-堿-酶穩定微球，其中內液的流速為10-160uL/min，內液與外液的流速比為1:30-40；

⑵構建藍光響應型大腸桿菌BL21工程菌株：利用PCR技術從模板Addgene#107742擴增pDawn-Ag43片段；利用PCR技術將載體pUC19線性化，并避開原有啟動子區域；利用同源重組，將pDawn-Ag43片段與pUC19載體連接，構建的質粒pUC19-pDawn-Ag43首先轉化DH5a感受態菌株，測序獲得重組陽性質粒；在此基礎上構建含有綠色熒光蛋白GFP報告基因的大腸桿菌BL21表達質粒pUC19-pDawn-Ag43-GFP及含有轉換生長因子TGF-β1免疫因子的大腸桿菌BL21表達質粒pUC19-pDawn-Ag43-TGF-β1；

⑶構建光響應型工程菌腸道靶向光遺傳載體：將培養至OD＝0.3-0.6的工程菌BL21pUC19-pDawn-Ag43-TGF-β1離心重懸后，混合稀土納米材料@酸-堿-酶穩定微球，加入到質量分數為0.1-0.5％的海藻酸鈉溶液中，其中工程菌BL21 p8UC19-pDawn-Ag43-TGF-β1：稀土納米材料@酸-堿-酶穩定微球：海藻酸鈉溶液的體積比為1-2:1:7-8；攪拌均勻后作為內液；二甲基硅油與CaCl₂超細粉末共混后作為外液，二甲基硅油與CaCl₂的比例mL：g為1-5：1；然后制備粒徑均一的藍光響應工程菌BL21@海藻酸鈉微球載稀土納米材料@酸-堿-酶穩定微球的雙組分微球；其中內液的流速為40-100uL/min，內液與外液的流速比為1：20-40；以上操作均為無菌操作；

將制備的雙組分微球與質量濃度1％-5％的殼聚糖溶液共混后封裝于注射器內，其中雙組分微球：殼聚糖溶液的體積比為1:5-10，注射器針頭呈45°彎曲，借助注射器的推力，均勻包裹殼聚糖的工程菌BL21@海藻酸鈉微球載稀土納米材料@酸-堿-酶穩定微球從注射器針頭擠出，冷凍干燥后即得到藍光響應工程菌BL21@pH敏感微球載稀土納米材料@酸-堿-酶穩定的雙組分微球，包裹殼聚糖的雙組分微球能夠避免胃酸的腐蝕，使稀土納米材料@酸-堿-酶穩定微球和光響應工程菌精準到達腸道。