[發明專利]制備檢測MCM5/NMP22雙指標免疫層析試劑盒

在審

• 申請號: 202010319759.1
• 申請日: 2020-04-21
• 公開（公告）號: CN113533714A
• 公開（公告）日: 2021-10-22
• 發明（設計）人: 楊琦
• 申請（專利權）人: 武漢市朗典精醫生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/533
• 分類號: G01N33/533;G01N33/543;G01N33/558;G01N33/574;G01N33/577
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本發明具體涉及一種同時檢測微小染色體維持蛋白5(Minichromosome maintenance protein5，MCM5)和核基質蛋白22(Nuclear matrix protein22，NMP22)免疫層析試劑盒，主要成分為免疫層析試紙條，由PVC底板上依次粘貼樣品墊、結合墊、硝酸纖維素膜和吸水紙組成。其中結合墊吸附有MCM5抗體?微球和NMP22抗體?微球，硝酸纖維素膜固定MCM5抗體形成檢測線1(T1線)，固定NMP22抗體形成檢測線2(T2線)，固定抗IgG抗體形成質控線(C線)。本發明同時公開了MCM5抗體和NMP22抗體偶聯微球過程。本發明建立MCM5/NMP22免疫層析試劑盒，同時檢測尿液中MCM5和NMP22濃度，用于篩查早期膀胱癌及監測膀胱癌的預后和復發。

技術領域

本發明屬于免疫學領域，具體涉及制備出MCM5抗體-熒光微球和NMP22抗體-熒光微球，建立檢測 MCM5/NMP22免疫層析試劑盒過程。

背景技術

膀胱癌是最常見泌尿系的惡性腫瘤，在我國已列為十大高發腫瘤之一，成為嚴重威脅人民健康、導致死亡的主要腫瘤。膀胱癌是高度可治療性的，早期發現膀胱癌尤為重要。由于膀胱癌的復發率高，50％～70％的淺表性腫瘤會在5年之內復發，且其中10％～20％進展為浸潤性腫瘤，需要對膀胱癌患者進行長期和連續的監測，因此，需要開發一種敏感性高，特異性強，非侵入性的檢測方法，檢測尿液中膀胱癌特異性標志物成為早期診斷膀胱癌并監測膀胱癌進展和復發的關鍵。

近年來，多種無創性的腫瘤標記物在膀胱癌中應用日益受到重視，微小染色體維持蛋白5(Minichromosome maintenance protein5，CMC5)和核基質蛋白22(NuclearMatrix Protein22，NMP22)是膀胱癌特異性標記物，檢測尿液中MCM5和NMP22濃度可用于早期篩查膀胱癌及監測膀胱癌的進展和復發。

細胞異常增殖是腫瘤發生發展過程中最核心的特征，其增殖活性與細胞周期密切相關，而細胞周期又受 DNA復制起始因子調控，因此，檢測DNA復制起始因子在腫瘤細胞中的表達水平，有助于腫瘤的篩查和預后判斷。微小染色體維持蛋白(Minichromosomemaintenance protein)是真核細胞DNA復制的主要調控因子之一，在DNA復制的起始和延長過程中發揮著重要作用，MCM家族成員包括MCM2-7六個亞單位，共同形成異質六聚體復合物，由于其獨特的超微結構，MCM被作為腫瘤標志物。

MCM家族成員中MCM5是細胞DNA復制的基礎成分，在靜止期細胞、終末分化細胞和衰老細胞缺乏MCM5表達，在正常膀胱上皮中MCM5表達僅限于基底干細細胞中；但增殖、轉化膀胱細胞中過度表達MCM5，能準確反映出細胞增殖活性，是細胞進入增殖期敏感而特異性指標。非侵入性和侵入性膀胱癌表達MCM5在所有層膀胱細胞中，包括表層上皮細胞，MCM5過度表達被視為特異性增殖的癌前病變標志物。過度表達MCM5 的癌前病變細胞或癌細胞可脫落到到尿液中，因此，測定尿沉積物中MCM5含量表明膀胱癌細胞的存在。研究證明，免疫熒光法檢測尿液沉積物中MCM5含量用于診斷膀胱癌，其靈敏度為92％，特異性為78％，尿液中MCM5成為早期篩查膀胱癌和評估預后的特異性指標。

NMP22為核有絲分裂蛋白復合物的一個亞單位，并與有絲分裂期間紡錘體的形成有關。其主要功能為協調核有絲分裂期間染色體正確、均等地分配到子細胞中，故NMP22多分布于細胞有絲分裂較為活躍的組織細胞中，如上皮細胞，尤其尿路上皮細胞。NMP22具有明顯的組織和細胞特異性，多種細胞癌變時都伴隨 NMP22改變，故NMP22作為尿路上皮特異性腫瘤的標記物。在膀胱癌細胞凋亡時，含NMP22癌細胞釋放進入尿液中，膀胱癌患者尿中NMP22含量明顯升高。研究表明，檢測NMP22診斷膀胱癌的敏感性，pTa期為51.7-55％，pT1期為46.1-83％，pT2期及更高期為70-83％。經過活檢證實的膀胱癌患者進行NMP22檢測，用10U/ml為臨界值，結果顯示NMP22對表淺性膀胱癌的敏感性為36-46.7％，對浸潤性膀胱癌的敏感性達73-90％。