[發明專利]檢測小細胞肺癌患者外周血循環腫瘤細胞NSE基因突變的免疫熒光試劑盒及檢測方法

在審

• 申請號: 202010316943.0
• 申請日: 2020-04-21
• 公開（公告）號: CN111521794A
• 公開（公告）日: 2020-08-11
• 發明（設計）人: 李浩;王振丹;李勝;黃寧;胡敏
• 申請（專利權）人: 山東第一醫科大學（山東省醫學科學院）
• 主分類號: G01N33/574
• 分類號: G01N33/574;G01N33/573;C12N5/09
• 代理公司: 濟南泉城專利商標事務所 37218
• 代理人: 李桂存

1.一種檢測小細胞肺癌患者外周血循環腫瘤細胞NSE基因突變的免疫熒光試劑盒，其特征在于，包括稀釋液45mL、、脫色液1mL、染色液A 0.5mL、染色液B 1mL、甲醇200μl、2% PFA200μl 、10%山羊血清100μl 、一抗工作液100μl、二抗工作液100μl、DAPI封片劑。

2.根據權利要求1所述的免疫熒光試劑盒，其特征在于，所述一抗工作液是由小鼠抗CK、大鼠抗CD45和 兔抗NSE組成，分別采用BD wash buffer按1:1001:5001:400稀釋混勻；所述二抗工作液是由熒光標記的小鼠抗羊、熒光標記的大鼠抗羊和熒光標記的兔抗羊組成，分別采用BD wash buffer按1:500稀釋混勻。

3.根據權利要求1所述的免疫熒光試劑盒，其特征在于，所述稀釋液是由1mmol/L EDTA+0.1% BSA+0.1%海藻糖+0.2%聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物組成，所述基礎液為Tris-HCl緩沖劑。

4.根據權利要求1所述的免疫熒光試劑盒，其特征在于，所述脫色液是由95%酒精與100%二甲苯按容積比1:1組成。

5.根據權利要求1所述的免疫熒光試劑盒，其特征在于，所述染色液A為DAB染色液；所述染色液B為蘇木素染色液。

6.一種利用權利要求1-5任一項所述的免疫熒光試劑盒非診斷目的檢測小細胞肺癌患者外周血循環腫瘤細胞NSE基因突變的方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）利用膜過濾裝置分離獲取無法獲得組織標本的晚期或復發小細胞肺癌患者外周血中的CTC：采集無法獲取組織標本的晚期或復發小細胞肺癌患者外周血：肘正中靜脈外周血5ml；

（2）外周血樣預處理：將采集的外周血樣采用稀釋液進行10倍稀釋，稀釋后加多聚甲醛固定外周血樣10分鐘，固定終濃度為0.25%；

（3）利用膜過濾分離腫瘤細胞裝置過濾外周血樣，分離獲得外周血CTC：將預處理的外周血樣加入到膜過濾分離腫瘤細胞裝置的血樣容器中，使其依靠重力自然過濾；

（4）過濾結束后，從膜過濾分離腫瘤細胞裝置中取下濾器，將循環腫瘤細胞染色液A液0.5ml加入到濾器中，染色3min，PBS緩沖液沖洗干凈；濾液過濾完全后加入染色液B液1ml，染色2min，純水1ml沖洗2次，向濾器中加入200μl 2% PFA，室溫固定5min，完成后0.5ml PBS漂洗3次，每次2min；再向濾器中加入200μl預冷的甲醇，4℃固定15min；取下濾膜，將濾膜下表面平整的貼附到載玻片一側，將載玻片置于室溫干燥4-5min后，使用鑷子快速將濾膜從載玻片表面一次性揭起，轉移至載玻片中央，滴加2ul貼片劑，干燥后在顯微鏡下觀察，確定是否存在CTC；

（5）運用免疫熒光法檢測CTC的NSE表達情況。

7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述檢測CTC的NSE表達的具體方法如下：

（1）脫色：將帶有CTC的濾膜從載玻片上取下，置于脫色液中浸泡4-6小時，脫去CTC染色液，PBS洗2min×3次；

（2）封閉：向濾膜上滴加100μl 10%山羊血清，室溫放置30min，完成后吸去多余的血清；

（3）一抗孵育：棄掉載玻片上的封閉液，并立即滴加100μl一抗稀釋液置于濕盒37℃孵育60min（或4℃過夜孵育，次日置于37℃復溫30min）；

（4）完成后PBS漂洗3次，每次3min；

（5）二抗孵育：滴加100μl二抗稀釋液，室溫孵育30min；

（6）完成后PBS漂洗3次，每次2min；

（7）使用含DAPI的封片劑封片，閱片，采圖；

（8）采照完成后，脫片后進行瑞氏吉姆薩染色，與IF結果進行對比。