[發明專利]檢測非小細胞肺癌患者外周血循環腫瘤細胞ALK基因突變的免疫熒光試劑盒及檢測方法

在審

• 申請號: 202010316535.5
• 申請日: 2020-04-21
• 公開（公告）號: CN111551727A
• 公開（公告）日: 2020-08-18
• 發明（設計）人: 王振丹;黃寧;李勝;劉智鴻;李浩
• 申請（專利權）人: 山東省腫瘤防治研究院（山東省腫瘤醫院）
• 主分類號: G01N33/58
• 分類號: G01N33/58;G01N33/574;G01N33/573
• 代理公司: 濟南泉城專利商標事務所 37218
• 代理人: 李桂存

本發明提供了一種檢測非小細胞肺癌患者外周血循環腫瘤細胞ALK基因突變的免疫熒光試劑盒及檢測方法，屬于分子生物學技術領域。該試劑盒包括稀釋液45mL、脫色液1mL、染色液A 0.5mL、染色液B 1mL、甲醇200μl、2% PFA 200μl、10%山羊血清100μl、一抗工作液100μl、二抗工作液100μl、DAPI封片劑。本發明提供的檢測方法，不用穿刺活檢獲取組織標本即可檢測到晚期或復發非小細胞肺癌患者ALK表達情況。該技術屬于微創，并能夠實時檢測。本發明提供的方法，能夠避免染色過程中可能產生的邊緣效應導致的假陽性結果，穩定性好，降低細胞的損失，提高檢測的準確性。

技術領域

本發明提供了一種檢測非小細胞肺癌患者外周血循環腫瘤細胞ALK基因突變的免疫熒光試劑盒及檢測方法，屬于分子生物學技術領域。

背景技術

肺癌是導致癌癥患者死亡的主要惡性腫瘤之一，在我國，肺癌的發病率和死亡率均居第一位。非小細胞肺癌（NSCLC）約占全部肺癌的85%，而這其中超過70%的NSCLC患者在確診時已為晚期。盡管手術和放化療等治療技術不斷提高，NSCLC患者5年生存率仍低于20%，主要死因包括局部復發與遠處轉移。

循環腫瘤細胞（Circulating tumor cell，CTC）是從實體腫瘤脫落進入外周血液循環的腫瘤細胞，自1989年被發現以來，目前已有多種方法用于外周血循環腫瘤細胞的檢測。近期研究表明，其檢測對于評估腫瘤患者尤其是晚期腫瘤患者的預后以及選擇合適的個體化治療具有重要的臨床意義。因CTC檢測具有微創、實時檢測等特點，被稱為腫瘤的“液態活檢”。

隨著分子生物學的發展，近年來以間變性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphomakinase, ALK)為靶點的分子靶向治療已成為NSCLC一種新的治療方案，尤其對于晚期（失去了手術機會）或手術后復發的NSCLC患者。肺癌中與ALK基因融合的其他基因還包括TFG、KIF5B等。針對ALK基因靶點的小分子抑制劑克唑替尼 (Crizotinib)是一種ATP競爭性酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor，TKI)，可特異性靶向抑制ALK，也可抑制c—MET和ROSl等信號通路，在NSCLC治療中已經取得顯著的成效。目前，國內外NSCLC診治指南均認為：NSCLC患者ALK突變檢測的時間點包括初診時及爭取在疾病進展時再次檢測，應通過重復檢測減少假陽性和假陰性。而目前臨床實踐中，NSCLC患者ALK檢測的標本主要為腫瘤組織，來源于手術或穿刺活檢，很難做到多次或實時檢測。

目前，山東省第一醫科大學、山東省藥物研究院聯合山東祺欣生物科技有限公司、山東喻曉生物科技有限公司、濟南杏恩生物科技有限公司、山東發現生物技術有限公司等單位，對于循環腫瘤細胞檢測鑒定關鍵技術進行產業化推廣的研究，本項目為山東省重大科技創新工程項目，本項目將以山東第一醫科大學濟南校區的山東省藥物研究院為核心，落實注冊人制度，依托循環腫瘤細胞檢測鑒定核心診斷技術，進一步注冊鑒定診斷試劑盒，以包括PD1、PD-L1、ER、PR、Her-2、GPC-3、VEGF、P53、Vimentin、TKI-EGFR、RAS、CK、ALK-D5F3、CD20、ALK/EML4、Beta-catenin、E-Cadherin、EP-CAM、HPV、IDH-1、PSA、PSMA、VEGF、GFAP、細胞角蛋白、AE1/AE3、雌激素受體、孕激素受體、BCA-225、CA 125、CEA、EMA、ERCC1、HPV、Ki-67、P53、TOP2A等作為CTCs表達的示蹤劑，注冊超靈敏、超快速、高覆蓋、低成本、準確特異的鑒定診斷試劑盒，通過與在濟南注冊的山東祺欣生物科技有限公司、山東喻曉生物科技有限公司、濟南杏恩生物科技有限公司、山東發現生物技術有限公司合作進行產業化推廣。

發明內容