[發明專利]13

在審

• 申請號: 202010316410.2
• 申請日: 2020-04-21
• 公開（公告）號: CN111493825A
• 公開（公告）日: 2020-08-07
• 發明（設計）人: 夏鶴春;王杰;吳亮;牛占鋒
• 申請（專利權）人: 寧夏醫科大學總醫院
• 主分類號: A61B5/00
• 分類號: A61B5/00;A61B5/055;G01N24/08;G01R33/465
• 代理公司: 寧夏合天律師事務所 64103
• 代理人: 郭立寧

1.¹³C標記葡萄糖計算脊髓損傷后不同腦區代謝水平的方法，其特征在于：所述方法包括如下步驟：

步驟（a）：根據實驗需要，采用不同的方法、儀器進行脊髓損傷模型制作；

步驟（b）：大鼠尾靜脈置管，注入[1-¹³C]葡萄糖，然后微波輻射法處死動物，分離目的腦區；

步驟（c）：目的腦區NMR樣品制備，NMR 原始數據采集；

步驟（d）：原始數據數據歸一化處理；

步驟（e）：代謝物濃度計算；

步驟（f）：代謝豐度計算。

2.如權利要求1所述的¹³C標記葡萄糖計算脊髓損傷后不同腦區代謝水平的方法，其特征在于：在步驟(a)中，可采用Model Ⅲ脊髓損傷打擊器、Allen打擊器做脊髓損傷模型，也可做脊髓損傷半切或全切模型。

3.如權利要求1所述的¹³C標記葡萄糖計算脊髓損傷后不同腦區代謝水平的方法，其特征在于：在步驟(b)中，用PE50管對一側尾側靜脈進行插管，注入[1-¹³C]葡萄糖，插管后，動物恢復約15分鐘，直到出現自主活動；輸液管路連接到旋轉裝置，并懸掛在籠子的中心，以避免在大鼠移動過程中管路纏繞。旋轉的另一端用PE50管連接到輸液泵，通過尾靜脈注入[1-¹³C]葡萄糖20分鐘。

4.如權利要求1所述的¹³C標記葡萄糖計算脊髓損傷后不同腦區代謝水平的方法，其特征在于：步驟（c）中，置入含有80μL0.1M HCl/甲醇的2ml EP管中。在組織勻漿機中勻漿1min，頻率為20 Hz，將400μL60%乙醇加入 EP管，再次勻漿2min。高速低溫離心機離心15min（4℃，14000 g），取上清液；600μL60%乙醇置入同一EP管中，相同條件再次勻漿、離心、取上清液，重復2次；將3次取得的上清液混合置于4ml EP管中，先后通過真空干燥機去除有機物甲醇和乙醇，冷凍干燥機去除水分，干燥樣品，將干燥后的樣品收集，-80℃保存。

5.如權利要求1所述的¹³C標記葡萄糖計算脊髓損傷后不同腦區代謝水平的方法，其特征在于：在步驟（c）中，NMR采集使用以下參數：采樣64次、重復時間20s、譜寬20ppm、回波時間8ms。

6.如權利要求1所述的¹³C標記葡萄糖計算脊髓損傷后不同腦區代謝水平的方法，其特征在于：在步驟（d）中，在TopSpin 2.1中轉換1H-NMR譜的所有FID信號，并手動執行相位和基線校正，然后在MATLAB中選用國產軟件NMR Spec處理譜圖。

7.如權利要求1所述的¹³C標記葡萄糖計算脊髓損傷后不同腦區代謝水平的方法，其特征在于：在步驟（e）中，用NMRSpec完成峰的對準、峰和化學相關峰的積分，所有的峰面積和譜圖數據都用傳統的概率商歸一化(PQN)方法進行歸一化，將一組平均化學相關峰面積設為參考“1”，然后根據NMR譜相同位置與平均峰面積之間的商值計算該代謝物在每個樣品中的相對濃度，然后計算各組代謝物平均濃度和標準差。

8.如權利要求7所述的¹³C標記葡萄糖計算脊髓損傷后不同腦區代謝水平的方法，其特征在于：在步驟（e）中，可用TSP作內標，腦中代謝物的總量可以通過完全弛豫的1H NMR 譜峰積分值得到，再除以腦濕重得到代謝物在腦中單位為 mmol/kg 腦濕重的絕對濃度。

9.如權利要求1所述的¹³C標記葡萄糖計算脊髓損傷后不同腦區代謝水平的方法，其特征在于：在步驟（f）中，代謝富集率通過減去POCE譜(2*¹³C)中的兩次自旋回波測量得到與¹³C相關的NMR譜，并根據這一與¹³C相關的NMR譜與未編輯的(¹²C+¹³C)譜的比值計算出¹³C的部分富集。因此，該值與組織重量和提取率以及用于分析的POCE光譜中的原始峰積分無關。