[發(fā)明專利]鑒定鱘魚性別的microRNA血清標(biāo)志物、引物組、試劑盒及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010314533.2
• 申請日: 2020-04-21
• 公開（公告）號: CN111206107B
• 公開（公告）日: 2020-07-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張秀娟;陳金平;吳文化;周佳濱;李林妙;江海英
• 申請（專利權(quán)）人: 廣東省生物資源應(yīng)用研究所
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/6879;C12N15/11
• 代理公司: 廣州科粵專利商標(biāo)代理有限公司 44001
• 代理人: 陳潔娣;劉明星

本發(fā)明提供了鑒定鱘魚性別的microRNA血清標(biāo)志物、引物組、試劑盒及其應(yīng)用。本發(fā)明利用高通量小RNA測序技術(shù)和microRNA芯片技術(shù)，篩選出3齡施氏鱘性腺（精巢和卵巢）差異表達(dá)miRNA種類和表達(dá)量，篩選其中36條miRNA用于篩選施氏鱘性別的血清miRNA標(biāo)記物，通過常規(guī)的血清RNA抽提、cDNA的獲得以及實(shí)時定量PCR等技術(shù)集合，建立了鱘魚性別鑒定的血清miRNA標(biāo)記物新方法，并在低齡的施氏鱘和西雜雜交鱘中驗證，本發(fā)明方法操作簡單，重復(fù)性好，是鱘魚性別高效早期鑒定技術(shù)領(lǐng)域的新突破，適合推廣應(yīng)用，從根本上解決鱘魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中生產(chǎn)成本高、效率低等嚴(yán)重制約產(chǎn)業(yè)發(fā)展的問題。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及鑒定鱘魚性別的microRNA血清標(biāo)志物、引物組、試劑盒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

鱘魚是極其名貴的魚類，由鱘魚籽制成的魚籽醬富含人體必需氨基酸、多種不飽和脂肪酸、維生素等物質(zhì)，營養(yǎng)價值極高，享有“黑色黃金”的美譽(yù)，在2013年其國際售價高達(dá)每千克800-900美元，因此雌性鱘魚比雄性鱘魚具有更高的經(jīng)濟(jì)價值。目前鱘魚養(yǎng)殖和魚子醬的生產(chǎn)作為新興產(chǎn)業(yè)，在我國發(fā)展異常迅速，據(jù)初步統(tǒng)計，我國鱘魚商品魚養(yǎng)殖年產(chǎn)量已突破2萬噸，占世界鱘魚總產(chǎn)量的66.17%，占養(yǎng)殖總產(chǎn)量的72.46%，儼然已經(jīng)是最大的鱘魚養(yǎng)殖國和主要的魚子醬出口國，有著巨大的市場潛力。如施氏鱘(Acipenser schrenckii)是我國黑龍江水系特有珍稀名貴的大型經(jīng)濟(jì)魚類。施氏鱘的人工繁育早在19世紀(jì)30年代開始，因其具有生長速度快、抗病力及適應(yīng)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，上個世紀(jì)90年代以來已成為養(yǎng)殖鱘魚中的雜交親本和魚籽醬生產(chǎn)的鱘魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中的重要養(yǎng)殖品種之一（Wei etal., 2011）。在養(yǎng)殖上能夠在施氏鱘早期進(jìn)行性別篩選，對雌、雄群體進(jìn)行定向選育，可以獲得更高的經(jīng)濟(jì)效益。但鱘魚雌雄個體之間在青年期甚至成年期都沒有明顯的第二性征，從形態(tài)上無法辨別雌雄，且性成熟時間較長。不能夠依照雌雄性別分別進(jìn)行集約化養(yǎng)殖或一定性別比例進(jìn)行飼養(yǎng)，造成飼養(yǎng)過多雄性個體的資源浪費(fèi)，增加了養(yǎng)殖成本，阻礙了鱘魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)化的快速發(fā)展。因此，鱘魚性別鑒定的新技術(shù)是目前鱘魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)可持續(xù)化發(fā)展的重點(diǎn)關(guān)注領(lǐng)域。

MicroRNA(miRNA)是一類長度為22bp左右、高度保守的非編碼小分子RNA，主要通過與靶基因的3'末端非翻譯區(qū)(3'UTR)的完全或不完全配對，降解靶基因或抑制其翻譯，從而參與廣泛的生命活動進(jìn)程，包括生長、分化、發(fā)育、腫瘤發(fā)生和配子形成等 (Ambros,2004; Ryazansky et al., 2014)。miRNA在血清中能夠長期穩(wěn)定存在，不易被RNA酶降解，煮沸、反復(fù)凍融、酸堿環(huán)境、長期保存等極端條件均不會造成血清 miRNA 的損失。更重要的是，新近研究表明血清中miRNA表達(dá)譜的變化與腫瘤的組織密切相關(guān)，能夠提示腫瘤的狀態(tài)，因此，miRNA作為一種有效的腫瘤標(biāo)志物的新技術(shù)用于癌癥的早期診斷、惡性分級、個性化診療和預(yù)后判斷被重點(diǎn)關(guān)注，甚至miRNA可以作為腫瘤治療的靶點(diǎn)，指導(dǎo)臨床用藥。

新近研究表明miRNA 靶向性別決定和分化基因在動物雌雄二型性特征形成方面發(fā)揮著精確有效的重要調(diào)控作用(Ryazansky et al., 2014; Fernandez-Perez et al.,2018)。如在小鼠，miR-124調(diào)控精巢分化Sox9基因(SRY-box containing gene 9)決定卵巢細(xì)胞的命運(yùn)(Real et al., 2013)；miR-202-5p/3p 受上游Sox9基因的調(diào)控在精巢分化中起作用 (Wainwright et al., 2013)；miR-19a/b靶向性別決定因子Dmrt1(doublesex andMab-3 related transcription factor 1)在性逆轉(zhuǎn)中發(fā)揮作用(Liu et al., 2015)。

發(fā)明內(nèi)容