[發明專利]葡萄早熟相關GDSL型酯酶/脂肪酶標志基因

有效

• 申請號: 202010314305.5
• 申請日: 2020-04-21
• 公開（公告）號: CN111349715B
• 公開（公告）日: 2021-08-27
• 發明（設計）人: 郭大龍;余義和;郭麗麗;張國海;鄭玉萍;尼沛藝;姬曉汝
• 申請（專利權）人: 河南科技大學
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6851
• 代理公司: 北京睿智保誠專利代理事務所(普通合伙) 11732
• 代理人: 周新楣

1.葡萄早熟相關GDSL型酯酶/脂肪酶標志基因在H₂O₂促葡萄早熟中的應用，其特征在于，包括如下步驟：

S1、選取對照組：選取自然生長的“峰早”葡萄和利用蒸餾水處理后的“巨峰”葡萄；

S2、實驗組處理：將300mmol/L的H₂O₂均勻噴涂在“巨峰”葡萄上，其中，第一次噴施為開花后25天，第二次為開花后35天，每個過程重復三次，每次重復五棵樹；

S3、收集材料：每次采樣從上午9點開始，用錫紙包起來，立即放入液氮罐中；

S4、采集樣本：每棵樹隨機抽取30個樣本，記錄果實發育的物候期數據；

S5、葡萄中GDSL型酯酶/脂肪酶基因家族鑒定；

S6、多序列比對和系統發育分析；

S7、葡萄中GELP基因的表達分析；

S8、RNA提取和實時熒光定量；

S9、與葡萄果實發育相關的候選VvGELP基因的篩選：

（1）采用TIANGEN試劑盒提取“巨峰”葡萄和“峰早”葡萄的果實總RNA；

（2）回收PCR產物；

（3）構建載體并與目的基因連接，將重組后的載體質粒轉入大腸桿菌；

（4）利用ExPASy在線分析工具對VvGELP76基因編碼的蛋白質進行氨基酸基本性質分析；

所述S5中，從Pfam網站中，下載GDSL型酯酶/脂肪酶結構域序列，利用隱馬爾可夫模型軟件HMMER進行比對搜索葡萄中的GELP基因，將得到的GELP基因蛋白序列用Clustalx進行比對建立新的HMM文件，然后利用HMMER軟件搜索葡萄中GELP基因，將得到的基因提交到SMART和CDD網站進行結構認證，保留其中含有GELP保守結構域的基因，數據處理中去掉重復基因以及基因中包含“N”的個數大于全長的30%的基因，并保留同一基因不同可變剪切中最長的氨基酸序列；葡萄基因組序列從EnsemblePlants數據庫下載；利用ExPASy在線分析工具對葡萄GELP基因編碼的蛋白質進行氨基酸基本性質分析；

所述S6中，用鑒定出的VvGELP基因蛋白序列與23個其他物種功能已知的GELP基因蛋白序列在MEGA7.0中構建系統發育樹，并將參數設置為：homogeneous pattern；pairwisedeletion；bootstrap值1000；23個功能已知的GELP蛋白序列從UniProt數據庫下載；

所述S7中，VvGELP基因的FPKM值來自RNA-seq數據，數據處理過程：計算每次生物學重復平均FPKM值，并取值log₁₀，利用軟件R將數據可視化；

S8中，用多糖多酚植物總RNA提取試劑盒對H₂O₂處理和對照的“巨峰”以及未處理“峰早”果實提取RNA，隨后用TaKaRa反轉錄試劑盒，反轉錄合成cDNA，作為模板用于PCR擴增，PCR擴增的引物為：

Gene name	Gene ID		Sequence (5'-3')	product
VvGELP3]]>	VIT_01s0137g00710	Forward	GGATACACAACACAGGTCCC	163
		Reverse	TGCTTTCTGAGTTCCACCAC
VvGELP5]]>	VIT_01s0137g00730	Forward	GTGAAGTACCGCCTCATCAG	190
		Reverse	CATCCCAGCTAATCCGAACC
VvGELP12]]>	VIT_05s0020g04840	Forward	TGGAGTGGTCTGTGATCCTT	85
		Reverse	CTCATTCACCCTCACTGCTC
VvGELP25]]>	VIT_09s0002g00490	Forward	ACGATTACATGAGCCCGTTC	83
		Reverse	GCCAATCACCATACCGACAT
VvGELP29]]>	VIT_09s0002g00530	Forward	GCATTTCCATCCAGAAGCAT	102
		Reverse	AATTTGCCCGTTGATCAGTG
VvGELP30]]>	VIT_09s0002g00540	Forward	TGGAGGCAATGACTACATAAGC	158
		Reverse	CCATGTTCACGAACCCAAAT
VvGELP36]]>	VIT_10s0003g00600	Forward	AGAGTTTATGGGACCAAGGTG	126
		Reverse	GCTCTTCTATACAGCCTCGTT
VvGELP43]]>	VIT_10s0003g02120	Forward	TCTTCCTTTCCAGACTCCATG	145
		Reverse	GCGAATATCAATGGGGTAAGC
VvGELP48]]>	VIT_13s0106g00250	Forward	CCGTGGAAAAGCTGAACAAC	94
		Reverse	CTCGCTTGCTTCTTCAATGC
VvGELP62]]>	VIT_14s0083g00850	Forward	ACTCCTCTCTCAACAACTCAC	168
		Reverse	TATACGGACACTAGGCTGTTG
VvGELP67]]>	VIT_15s0046g01450	Forward	CTCCTGCCAAACACTTCCTT	164
		Reverse	AACGTGTAGAGGGATTTCGC
VvGELP70]]>	VIT_17s0000g10060	Forward	AGGCTAGTGATCGACTTTGTTG	185
		Reverse	TGAGTTTGGATTGACTGAGGAG
VvGELP76]]>	VIT_18s0001g14800	Forward	TCCGGGCAATAACAACAATC	127
		Reverse	GGCAATGAAGTCAGACGGAAT
VvGELP82]]>	VIT_19s0090g00660	Forward	AACGCTGCTGATTTTCTTGC	141
		Reverse	ATCAAAGATTCCGGCACCTC

根據S6和S8篩選出VvGELP76為參與葡萄果實發育成熟的候選基因；

在采用TIANGEN試劑盒提取“巨峰”葡萄和“峰早”葡萄的果實總RNA中，以總RNA為模版，反轉錄合成cDNA，利用Primer3設計特異性引物，克隆VvGELP76基因全長的引物序列為：VvGELP76 Forward：AACTGTGGTCGTCTTCTCG，VvGELP76 Reverse：CCACGCATTTCTGGATGATC，以反轉錄生成的cDNA為模板進行PCR擴增，反應程序為：95℃預變性3 min；95℃ 20 s，58℃30 s，72℃ 30 s，35個循環；最后，72℃延伸5 min。