[發(fā)明專利]重組仙臺病毒的構(gòu)建方法及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010313056.8
• 申請日: 2020-04-20
• 公開（公告）號: CN112538498B
• 公開（公告）日: 2023-04-25
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張曦;蕭哲
• 申請（專利權(quán)）人: 梅爾頓（深圳）生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N7/01
• 代理公司: 北京惠科金知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11981
• 代理人: 瞿曉晶

本發(fā)明提供一種重組仙臺病毒的構(gòu)建方法，包括：構(gòu)建質(zhì)粒pCAGGS?NP/P/L；以仙臺病毒逆轉(zhuǎn)錄樣品為模板擴(kuò)增SeV?01/02?DNA；擴(kuò)增線性化pUC57?insert質(zhì)粒收集pUC?insert?DNA；將SeV?01/02?DNA片段和pUC?insert?DNA融合，獲得Sev?full質(zhì)粒，酶切得到Sev?full?Not1；合成pUC57?A質(zhì)粒，酶切收集A?Not1，與Sev?full?Not1連接得到Sev?A質(zhì)粒；提供293T細(xì)胞，加入pCAGGS?NP/P/L、Sev?A和T7?opt三種質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染得到重組仙臺病毒。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種重組仙臺病毒的構(gòu)建方法，一種用于將PBMC重編程為iPS的試劑盒，以及一種將PBMC重編程為iPS細(xì)胞的方法。

背景技術(shù)

仙臺病毒(SeV)，也稱為1型副流感病毒或HVJ(Hemagglutinating?Virus?ofJapan，日本血凝病毒)，是副粘病毒科的一種負(fù)鏈單股單鏈RNA病毒。仙臺病毒具有以下特征：(1)仙臺病毒的生命周期中，病毒蛋白和基因組均在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，病毒基因組不與細(xì)胞基因組進(jìn)行整合；(2)仙臺病毒能夠在細(xì)胞全生命周期內(nèi)進(jìn)行感染，能夠以極高的效率感染大多數(shù)細(xì)胞，包括慢病毒難以感染的細(xì)胞類型；(3)表達(dá)外源基因高效并且可調(diào)控，在體內(nèi)和體外實驗中均可以檢測到高表達(dá)的目的基因。由于具有上述特征，仙臺病毒能夠通過反向遺傳學(xué)的開發(fā)，成功地進(jìn)行重組改造，以表達(dá)相應(yīng)的外源基因，同時不會將基因重組引入宿主細(xì)胞基因組。因此，仙臺病毒作為一種高效的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)工具被廣泛研究。

山中伸彌(Shinya?Yamanaka)和高橋和利(Kazutoshi?Takahashi)在2006年8月報道了將小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEFs)細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)性多能干(iPS)細(xì)胞。該方法使用逆轉(zhuǎn)錄病毒進(jìn)行基因?qū)氩僮鳎诓《巨D(zhuǎn)基因進(jìn)入細(xì)胞基因組時容易造成致癌風(fēng)險。目前，科學(xué)家們已經(jīng)開發(fā)了數(shù)種方法用于細(xì)胞重編程誘導(dǎo)產(chǎn)生iPS細(xì)胞，包括腺病毒載體和轉(zhuǎn)座子替代方法，依然存在病毒整合風(fēng)險。使用質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染或小分子誘導(dǎo)生成iPS細(xì)胞，由于蛋白表達(dá)水平較低，因此重編程效率低下。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種重組仙臺病毒的構(gòu)建方法，旨在解決細(xì)胞重編程誘導(dǎo)產(chǎn)生iPS細(xì)胞的方法，重編程效率低，且包裝病毒純度中容易引入其他活性病毒的問題的問題。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種采用上述方法制備的重組仙臺病毒將PBMC重編程為iPS的試劑盒和方法。

為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明第一方面提供一種重組仙臺病毒的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

提供pCAGGS線性化載體、NP基因、P基因和L基因，將NP基因、P基因和L基因分別與pCAGGS線性化載體融合，構(gòu)建質(zhì)粒pCAGGS-NP、質(zhì)粒pCAGGS-P和質(zhì)粒pCAGGS-L；

以仙臺病毒逆轉(zhuǎn)錄樣品為模板，使用高保真DNA聚合酶Phanta?EVO分別采用第一引物對和第二引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得仙臺基因組SeV-01?DNA片段和SeV-02?DNA片段；在pUC57-Simple中插入第一序列，獲得pUC57-inser質(zhì)粒，采用EcorI-HF酶切后獲得線性化pUC57-insert質(zhì)粒；采用第三引物對對線性化pUC57-insert質(zhì)粒擴(kuò)增，獲得pUC-insertDNA；將SeV-01?DNA片段、SeV-02?DNA片段和pUC-insert?DNA融合，獲得Sev-full質(zhì)粒；

在pUC57-Simple中插入表達(dá)功能性基團(tuán)A的第二序列，獲得pUC57-A質(zhì)粒，NotI-HF限制性內(nèi)切酶酶切后，收集A-Not1酶切片段；使用NotI-HF限制性內(nèi)切酶對Sev-full質(zhì)粒酶切處理，收集Sev-full-Not1酶切片段；將A-Not1酶切片段和Sev-full-Not1酶切片段連接，得到Sev-A質(zhì)粒；