[發明專利]一種檢測前列腺癌患者外周血循環腫瘤細胞AR-V7表達的免疫熒光試劑盒及檢測方法

在審

• 申請號: 202010312681.0
• 申請日: 2020-04-20
• 公開（公告）號: CN111596055A
• 公開（公告）日: 2020-08-28
• 發明（設計）人: 王煥昇;李勝;李浩;高德海;戚元剛
• 申請（專利權）人: 山東第一醫科大學（山東省醫學科學院）
• 主分類號: G01N33/574
• 分類號: G01N33/574;C12N5/09
• 代理公司: 濟南泉城專利商標事務所 37218
• 代理人: 李桂存

1.一種檢測前列腺癌患者外周血循環腫瘤細胞AR-V7蛋白表達的試劑盒，其特征在于，包括稀釋液45mL，脫色液1mL，染色液A 0.5mL，染色液B 1mL，200μl 甲醇、200μl 2%PFA，100μl10%山羊血清，小鼠抗CK、大鼠抗CD45和兔抗AR-V7組成的一抗混懸液100μl，熒光標記的羊抗小鼠、熒光標記的羊抗大鼠、熒光標記的羊抗兔組成的二抗混懸液100μL，DAPI封片劑；

一抗混懸液中小鼠抗CK、大鼠抗CD45和兔抗AR-V7分別按1:100、1:400和1:500稀釋，總體積為100μL；

二抗混懸液中熒光標記的羊抗小鼠、熒光標記的羊抗大鼠、熒光標記的羊抗兔按1:500稀釋。

2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述稀釋液為1mmol/L EDTA+0.1% BSA+0.3%硫酸鐵+0.5%蔗糖。

3.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述脫色液是由95%酒精與100%二甲苯按體積比1:1組成。

4.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述染色液A為DAB染色液；所述染色液B為蘇木素染色液。

5.一種利用權利要求1-4任一項所述的試劑盒非診斷目的檢測前列腺癌患者外周血循環腫瘤細胞AR-V7表達的方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）利用膜過濾裝置分離獲取無法獲得組織標本的晚期或復發前列腺癌患者外周血：采集無法獲取組織標本的晚期或復發前列腺癌患者肘正中靜脈外周血5ml；

（2）外周血樣預處理：將采集的外周血樣采用稀釋液進行10倍稀釋，稀釋后加多聚甲醛固定外周血樣10分鐘，固定終濃度為0.25%；

（3）利用膜過濾分離腫瘤細胞裝置過濾外周血樣，分離獲得外周血CTC：將預處理的外周血樣加入到膜過濾分離腫瘤細胞裝置的血樣容器中，使其依靠重力自然過濾；

（4）過濾結束后，從膜過濾分離腫瘤細胞裝置中取下濾器，將循環腫瘤細胞染色液A液0.5ml加入到濾器中，染色3min，PBS緩沖液沖洗干凈；濾液過濾完全后加入染色液B液1ml，染色2min，純水1ml沖洗2次；

（5）向濾器中加入200μl 2%PFA，室溫固定5min，完成后0.5ml PBS漂洗3次，每次2min；

（6）再向濾器中加入200μl預冷的甲醇，4℃固定15min，取下濾膜，放置在載玻片上，干燥后在顯微鏡下觀察，確定是否存在CTC；

（7）運用免疫熒光方法檢測外周血CTC的AR-V7表達情況。

6.根據權利要求5所述的檢測方法，其特征在于，步驟（7）所述檢測外周血CTC的AR-V7表達的具體方法如下：

（1）脫色：將帶有CTC的濾膜從載玻片上取下，置于脫色液中浸泡4-6小時，脫去CTC染色液，PBS洗2min×3次；

（2）封閉：向濾膜上滴加100μl 10%山羊血清，室溫放置30min，完成后吸去多余的血清（注：羊血清用PBS稀釋）；

（3） 一抗孵育：向濾膜上滴加100μl小鼠抗CK、大鼠抗CD45和兔抗E-Cadherin組成的一抗混懸液，37℃孵育1h或4℃過夜，完成后PBS洗3min×3次；

（4）二抗孵育：向濾膜上滴加100μl熒光標記的羊抗小鼠、熒光標記的羊抗大鼠、熒光標記的羊抗兔組成的二抗混懸液，室溫孵育30min，完成后PBS洗2min×3次；

（5）使用含DAPI的封片劑封片，閱片，采圖；

（6）采圖完成后，脫片后進行瑞氏吉姆薩染色，與IF結果進行對比。