[發明專利]花生毛狀根株系在提高花生耐低氮、耐高鹽能力中的應用

有效

• 申請號: 202010312520.1
• 申請日: 2020-04-20
• 公開（公告）號: CN111411124B
• 公開（公告）日: 2022-03-11
• 發明（設計）人: 徐揚;于子鵬;張智猛;戴良香;丁紅;慈敦偉;張冠初
• 申請（專利權）人: 山東省花生研究所
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/29;A01H5/06;A01H6/54;C12Q1/6895;A01H1/04
• 代理公司: 青島清泰聯信知識產權代理有限公司 37256
• 代理人: 張潔

1.花生毛狀根株系在提高花生耐低氮、耐高鹽能力中的應用，其特征在于，所述花生毛狀根株系是通過以下方法得到的，具體步驟如下：

從花生cDNA中利用AhCEP1基因引物序列克隆出AhCEP1基因后，將所述AhCEP1基因連接到35S超表達載體pCAMBIA1300上，構建含AhCEP1基因的植物表達載體；其中，AhCEP1基因引物包括：

上游引物5’-GGATCCATGGCCAATTCCAAACTTGTGTTG-3’；

下游引物5’-GAGCTCCTAGTTTGGCGTGGGGGAGG-3’；

將含AhCEP1基因的植物表達載體轉化至發根農桿菌，獲得含AhCEP1基因的發根農桿菌；

利用含AhCEP1基因的發根農桿菌菌液侵染花生葉片，得到被含AhCEP1基因的發根農桿菌菌液侵染的花生葉片后，誘導其產生轉基因花生毛狀根，轉入含有卡那霉素的MS固體培養基上繼代培養，然后轉移至MS液體培養基上擴大培養；

鑒定所述轉基因花生毛狀根中AhCEP1基因表達后，測定所述轉基因花生毛狀根中AhCEP1基因的表達量，并篩選轉基因花生毛狀根陽性株系，即得花生毛狀根株系35S:AhCEP1。

2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，構建所述植物表達載體的方法為酶切連接法或gateway系統構建法。

3.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，利用所述含AhCEP1基因的發根農桿菌菌液侵染花生葉片的方法為浸泡法或涂抹法。

4.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述含AhCEP1基因的發根農桿菌菌液濃度OD600為1.0-2.0；所述轉基因花生毛狀根的培養時間為2周-8周，每隔2周更換一次新鮮的培養液。

5.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，鑒定所述轉基因花生毛狀根中AhCEP1基因表達的方法為RT-PCR法或qRT-PCR法。

6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于，測定所述AhCEP1基因的表達量是通過如下方法實現的，具體為：

利用RT-PCR法或qRT-PCR法鑒定所述轉基因花生毛狀根中AhCEP1基因表達，得到不同的PCR產物；

將所述PCR產物分別進行瓊脂糖凝膠電泳分析，根據條帶的亮度大小判斷所述轉基因花生毛狀根中AhCEP1基因的表達量。

7.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述方法還包括測定所述轉基因花生毛狀根陽性株系的生物量，步驟如下：

從同一轉基因花生毛狀根陽性株系中選擇分支，稱重后轉移至液體培養基中繼續培養；

每隔1-2周更換新鮮的液體培養基，最后用無菌水洗凈晾干，分別稱量不同轉基因花生毛狀根鮮重，即得所述轉基因花生毛狀根的生物量，公式如下：

轉基因花生毛狀根鮮重=每瓶轉基因花生毛狀根重量-接種重量。

8.根據權利要求7所述的應用，其特征在于，所述液體培養基為MS液體培養基、低氮液體培養基和高鹽液體培養基。

9.根據權利要求7所述的應用，其特征在于，轉基因花生毛狀根分支的培養條件為23-26℃、150-180rpm。

10.如權利要求1-9任一項所述的應用，低氮是指在所述液體培養基中的KNO₃的濃度≤1mM，高鹽是指在液體培養基中NaCl的濃度≥200mM。