[發(fā)明專利]高纖溶活性的豆豉纖溶酶的制備和應(yīng)用

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202010306225.5
• 申請日: 2020-04-17
• 公開（公告）號: CN111394340A
• 公開（公告）日: 2020-07-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉歡
• 申請（專利權(quán)）人: 劉歡
• 主分類號: C12N9/50
• 分類號: C12N9/50;C12N15/57;C12N15/70
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.高纖溶活性豆豉纖溶酶，其特征在于，所述酶氨基酸序列(DFE27 enzyme，Ge nBank:AWA46506.1)在第157位、第187位上發(fā)生突變，由原來的A、G分別突變?yōu)镚、R，構(gòu)建方法包括以下步驟：

1)從NCBI上獲得豆豉纖溶酶序列(DFE27 enzyme，GenBank:AWA46506.1)，交生物公司合成，設(shè)計(jì)PCR引物F:5'-AATTAATTCGGATCCGAATTCATGAGCACGATGAGCGCCG-3'，R:TGGTGGTGCTCGAGTGCGGCCGCAGAAGCATCACCAAGTTTTGTAGTG，PCR反應(yīng)結(jié)束后，加20μl Cloning Enhancer到PCR體系中，37℃孵育15min，80℃孵育15min，采用EcoRⅠ、NotⅠ酶切pET20b(+)質(zhì)粒，酶切產(chǎn)物經(jīng)過0.75％瓊脂糖凝膠電泳后回收，溶于滅菌雙蒸水中，將孵育后的PCR產(chǎn)物與純化的線性載體混合均勻，加入In-Fusion酶，50℃反應(yīng)15min，轉(zhuǎn)化E.coli JM109，挑取陽性克隆，送生物公司測序，將鑒定正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主E.coli BL21進(jìn)行表達(dá)，得到含有野生型序列質(zhì)粒的基因工程菌；

2)質(zhì)粒DNA的提取

將攜帶有質(zhì)粒pET20b(+)/DFE27的E.coli BL21基因工程菌接種于LB/Amp(Amp終濃度100μg/ml)液體培養(yǎng)基中，于37℃，200r/min過夜培養(yǎng)后，使用質(zhì)粒小量提取試劑盒抽提質(zhì)粒，具體操作按照說明書進(jìn)行；

3)易錯(cuò)PCR擴(kuò)增與突變文庫的構(gòu)建

以步驟二獲得的質(zhì)粒為模板，用NotⅠ酶切使質(zhì)粒線性化，用引物序列F:5'-AATTAATTCGGATCCGAATTCATGAGCACGATGAGCGCCG-3'，R:TGGTGGTGCTCGAGTGCGGCCGCAGAAGCATCACCAAGTTTTGTAGTG，進(jìn)行易錯(cuò)PCR擴(kuò)增基因，易錯(cuò)PCR擴(kuò)增體系(50μl)為10×TaKaRa Taq Buffer，dNTPs Mixture，引物各0.2μmol/L，模板DNA 200ng，Taq DNA聚合酶2.5U，5mmol/l Mn²⁺，0.5U/μl的Taq DNA聚合酶2.5μl，7mmol/l的Mg²⁺,PCR反應(yīng)條件：95℃5min，94℃1min，55℃1min，72℃2min，35個(gè)循環(huán)，72℃10min，加20μl Cloning Enhancer到PCR體系中，37℃孵育15min，80℃孵育15min，將pET20b(+)質(zhì)粒用EcoRⅠ、NotⅠ酶切線性化，酶切產(chǎn)物經(jīng)過0.75％瓊脂糖凝膠電泳后回收，溶于滅菌雙蒸水中，將孵育后的PCR產(chǎn)物與純化的線性載體混合均勻，加入In-Fusion酶，50℃反應(yīng)15min，轉(zhuǎn)化E.coli BL21，涂布于固體LB平板(100μg/mlAmp)抗性篩選陽性轉(zhuǎn)化子，所有轉(zhuǎn)化子構(gòu)成突變體文庫；

4)突變文庫的高通量篩選

將步驟三得到的轉(zhuǎn)化后的菌液均勻地涂在預(yù)先涂有4μl IPTG(5mg/ml)直徑為9mm含有氨芐青霉素的LB平板上，涂抹的轉(zhuǎn)化液用量以最終每個(gè)平板大約長出50個(gè)單菌落為宜，37℃培養(yǎng)15h左右，再于4℃下放置1-2h，然后將無菌尼龍膜完全浸濕，立即以平穩(wěn)的一次性動(dòng)作將尼龍膜從瓊脂面上揭下，將尼龍膜的菌落面向上，置于一塊新的LB平板上(預(yù)先涂有4μl 5mg/ml IPTG)，37℃下培養(yǎng)4-5h后進(jìn)行菌落的裂解處理，用細(xì)胞壁裂解液(25mmol/lTris-HCl pH8.0,內(nèi)含1mg/ml溶菌酶和1mmol/l EDTA pH8.0)、細(xì)胞膜裂解液(10mmol/lTris-HCl pH8.0,內(nèi)含0.1％(w/v)Triton-x-100)和平衡緩沖液(50mmol/l Tris-HClpH8.0)分別浸泡3張濾紙，取出后放在干凈的培養(yǎng)皿內(nèi)，用玻棒趕去多余液體以防止菌落被沖散，將尼龍膜正面向上按細(xì)胞壁裂解液、細(xì)胞膜裂解液、平衡緩沖液的順序依次置于3張濾紙上于室溫分別處理30min，將上述處理好的尼龍膜菌落面向下鋪于篩選平板(2％瓊脂粉，0.5％羧甲基纖維素CMC，0.1mol/l pH6.6咪唑-鄰苯二鉀酸氫鉀緩沖液)上，70℃反應(yīng)3h，揭去尼龍膜后，在篩選平板上加入適量1mol/l NaCl脫色15min，與尼龍膜上對應(yīng)的有活性的克隆子周圍會(huì)出現(xiàn)明顯的透明圈；將透明圈比野生型對照大的突變子，挑出后復(fù)篩；

5)將復(fù)篩通過的陽性克隆，送生物公司測序；

6)突變體的生產(chǎn)，將步驟五的含有突變質(zhì)粒的E.coli BL21發(fā)酵培養(yǎng)；

7)突變體的純化，采用分子篩的方法純化突變體；

8)對突變體進(jìn)行SDS-PAGE電泳；

9)采用Bradford測定蛋白質(zhì)濃度。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高纖溶活性的豆豉纖溶酶的應(yīng)用，其特征在于，所述酶用于溶解血栓。