[發明專利]用于檢測犬腺病毒的RPA引物對、探針、試劑盒及檢測方法

有效

• 申請號: 202010301308.5
• 申請日: 2020-04-16
• 公開（公告）號: CN111334613B
• 公開（公告）日: 2023-04-25
• 發明（設計）人: 練月曉;叢鋒;黃韌;朱才毅
• 申請（專利權）人: 廣東省實驗動物監測所;廣州千尋生物技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12R1/93
• 代理公司: 廣州本諾知識產權代理事務所(普通合伙) 44574
• 代理人: 朱彩霞

本發明公開了一種用于檢測犬腺病毒的RPA引物對、探針、試劑盒及檢測方法，屬于分子生物學檢測技術領域。本發明提供的犬腺病毒RPA實時熒光檢測方法，擴增特異性強，且敏感度高，靈敏度可以達到10supgt;2/supgt;拷貝。本發明的引物對和探針是針對犬腺病毒(CAV)E3基因序列設計篩選獲得的，因此擴增更高效，特異性更強。本發明RPA方法簡單，對溫度和機器要求低，用時短，適合實驗室或現場快速檢測，為犬腺病毒快速檢測診斷及防控提供了技術參考。

技術領域

本發明涉及一種用于檢測犬腺病毒的RPA引物對、探針、試劑盒及檢測方法，屬于分子生物學檢測技術領域。

背景技術

犬腺病毒可分為犬腺病毒1型(Canine?adenovirus?type?1，CAV-1)和犬腺病毒2型(Canine?adenovirus?type?2，CAV-2)，犬腺病毒1型又稱傳染性肝炎、狐腦炎病毒、羅巴斯病病毒，是由犬腺病毒1型引起犬等動物的一種急性敗血性傳染病。主要發生于犬，也可見于其他犬科、鼬科、熊科動物。在犬主要表現肝炎和循環障礙，在狐貍、熊則表現為腦炎。犬腺病毒在分類上屬于腺病毒科(Adenoviridae)，哺乳動物腺病毒屬(Mastadenovirus)。犬腺病毒自然感染潛伏期6-9天，最急性病例，在嘔吐，腹痛和腹瀉等癥狀出現后數小時內死亡。急性型病例，患犬怕冷，體溫升高(39.4-41.1℃)，精神抑郁，食欲廢絕，渴欲增加，嘔吐，腹瀉，糞中帶血。亞急性病例癥狀輕微咽炎和喉炎可致扁桃體腫大；頸淋巴結發炎可致頭頸部水腫。特征性癥狀是角膜水腫，即“藍眼”病。眼疼痛反射通常在角膜完全渾濁后逐漸減弱，但若發展為青光眼或角膜穿孔則病情加劇。慢性病例多發于老疫區或疫病流行后期，多不死亡，可以治愈。犬腺病毒對犬尤其是1年內的幼犬有嚴重危害，能引起犬的肝、膽、腎、淋巴器官的病變。還能引起犬的血象變化，如白細胞和血小板減少等，可對相關實驗數據造成誤差。此外，大劑量接種可使豚鼠感染，以豚鼠作為實驗動物也存在潛在影響。犬腺病毒2型(Canine?adenovirus?type?2，CAV-2)可引起犬的傳染性喉氣管炎，臨床表現為持續高熱、咳嗽、漿液-黏液性鼻漏、扁桃體炎、喉氣管炎和肺炎，還能引起腹瀉。犬腺病毒2型代表株多倫多A26/61的基因組大小為31323bp，與犬腺病毒1型的同源性為89％，基因組分區和犬腺病毒1型相似，犬腺病毒1型和2型的E3區兩側的基因高度同源，表現在犬腺病毒2型的E3區比犬腺病毒1型長500bp。犬腺病毒對幼犬的危害非常大，感染率近幾年有上升的趨勢，因此建立一種及時、準確的檢測技術，對該病的防控具有十分重要的意義。

目前，診斷犬腺病毒的實驗方法有病毒分離法、PCR法，包括普通PCR方法和熒光定量PCR方法、間接免疫熒光法、瓊脂擴散試驗法(AGP)、HA/HI、補體結合實驗、中和試驗和ELISA方法，還有最近發展的環介導等溫擴增方法(LAMP)。其中，PCR方法因其簡便快捷而被廣泛使用的檢測方法，傳統診斷犬腺病毒的方法依賴于PCR檢測方法。但操作時間過長且對操作要求高。LAMP方法是一種等溫擴增利用2對引物的方法，但引物設計麻煩且假陽性率高。

重組酶聚合酶擴增(Recombinase?polymerase?amplification?RPA)是近年來發展起來的一種快速診斷不同病原的方法，已廣泛用于病毒、細菌、寄生蟲診斷中。RPA利用重組酶蛋白與引物形成復合物；該復合物促進引物與雙鏈DNA的同源靶序列的結合，聚合酶進行后續的合成，整個過程僅需在37-42℃下反應20-30分鐘即可。與普通PCR方法和熒光定量PCR方法相比，整個過程不需要高溫變性和低溫退火步驟，操作簡單，不需要昂貴的儀器。與傳統的CAV診斷方法相比，反應時間快。RPA引物比一般PCR引物長，通常需要達到30-35個堿基，擴增產物在300bp以內。

目前國內外尚無采用實時熒光RPA檢測CAV的報道，因此建立快速準確的檢測犬腺病毒CAV的RPA方法非常有必要。

發明內容