[發(fā)明專利]一種昆蟲淺色觸角內(nèi)淋巴管可視化的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010300925.3
• 申請(qǐng)日: 2020-04-16
• 公開（公告）號(hào): CN111458334B
• 公開（公告）日: 2022-12-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 曹軍;郭凱飛;駱輝;賈蕊霞;劉一淼;焦?jié)櫧?/a>;代曼;葉輝
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 云南大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N21/84
• 分類號(hào): G01N21/84;G01N1/30
• 代理公司: 昆明科眾知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 53218
• 代理人: 方金敏

1.一種昆蟲淺色觸角內(nèi)淋巴管可視化的方法，包括以下步驟：

步驟1)活體觸角的分離：先將50ml Ringer液倒入100ml燒杯中，在Ringer液中持續(xù)充入氣體；在一個(gè)凹孔型載玻片上滴上幾滴Ringer液，隨后在體式顯微鏡下，在載玻片上的Ringer液中用眼科剪在昆蟲觸角根部剪下觸角，然后使用Ringer液清洗3遍離體觸角；

步驟2)組織固定：用尖頭鑷子輕輕地將觸角轉(zhuǎn)移到一個(gè)干凈的PCR管中，滴上2-4滴濃度5％的甲醛溶液，固定10分鐘后除去該甲醛溶液；然后再滴上2-4滴濃度10％的甲醛溶液，再固定10分鐘；最后用干燥的濾紙條吸除多余的甲醛溶液；

步驟3)組織脫水：用尖頭鑷子將組織固定后的昆蟲觸角轉(zhuǎn)移到另一個(gè)干凈的PCR管中，依次用70％、80％、90％、100％濃度的酒精進(jìn)行四次脫水，每次脫水時(shí)間為5分鐘；

步驟4)姿態(tài)固定與顯影：使用細(xì)鑷將步驟3)處理過的昆蟲觸角以水平姿態(tài)固定在載玻片上的小井裝置中，并進(jìn)行姿態(tài)微細(xì)調(diào)整和固定，然后滴入液體M；同時(shí)在體式顯微鏡下保持時(shí)刻觀察，1-2分鐘內(nèi)，觸角內(nèi)淋巴管在顯微鏡視野下逐漸顯色；

步驟5)整體拍照：立即置于不同倍率的常規(guī)光學(xué)顯微鏡下，觀察并采集完成完整觸角內(nèi)淋巴管的圖像信息；

步驟4)中所述的液體M的折射率控制在1.5±0.1之間，所述的液體M為水楊酸甲酯、甲苯、二甲苯、氯仿、香柏油中的任意一種；

該方法能夠在不使用示蹤劑、不進(jìn)行切片處理，僅使用普通的生物級(jí)顯微鏡的條件下，在成蟲觸角上實(shí)現(xiàn)完整觸角內(nèi)淋巴管的原位可視化。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的昆蟲淺色觸角內(nèi)淋巴管可視化的方法，其特征在于：步驟1)中，所述的燒杯埋于冰中，以保持Ringer液冰冷。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的昆蟲淺色觸角內(nèi)淋巴管可視化的方法，其特征在于：步驟1)中，所述的氣體為體積95％氧氣和5％二氧化碳構(gòu)成的混合氣體。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的昆蟲淺色觸角內(nèi)淋巴管可視化的方法，其特征在于：將步驟2)中濃度5％的甲醛溶液和濃度10％的甲醛溶液均替換為濃度4％的多聚甲醛溶液。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的昆蟲淺色觸角內(nèi)淋巴管可視化的方法，其特征在于：所述的步驟5)拍照時(shí)間控制在3-5分鐘內(nèi)完成。