[發明專利]干細胞高效表達目的蛋白的制備方法和應用方法

在審

• 申請號: 202010295429.3
• 申請日: 2020-04-15
• 公開（公告）號: CN111440821A
• 公開（公告）日: 2020-07-24
• 發明（設計）人: 劉榮坤;劉芳;岳緒娥
• 申請（專利權）人: 北京本真工坊生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/67;C12N15/65;C12N15/62;C12N5/0775
• 代理公司: 北京匯信合知識產權代理有限公司 11335
• 代理人: 王維新

本發明公開了一種干細胞高效表達目的蛋白的制備方法和應用方法，其中制備方法包括：從人體組織中分離干細胞并進行培養；結合PB轉座子、EF1A啟動子序列、KOZAK序列、所要表達的目的蛋白序列、T2A序列、所要表達目的蛋白序列、CD33信號肽序列、IRES序列、PURO序列和附加體系統，構建重組表達載體；將重組表達載體加入干細胞的培養懸液，采用電轉染方式獲得能夠表達目的蛋白的干細胞。通過本發明的技術方案，可以將重組表達載體轉移至干細胞中，迅速獲得高表達的細胞，可以增加兩種細胞因子的協同作用，使兩種細胞因子同時表達，使重組表達載體質粒在干細胞內長時間存在并高效表達目的蛋白。

技術領域

本發明涉及干細胞外泌體技術領域，尤其涉及一種干細胞高效表達目的蛋白的制備方法和一種干細胞高效表達目的蛋白的應用方法。

背景技術

干細胞外泌體在國外研究已經多年，用于市場上的外泌體越來越多，而國內對于干細胞外泌體的應用也隨之越來越多，但是干細胞外泌體表達濃度低應用效果一般，對目的蛋白外泌體的表達效率較低、蛋白表達量較低。

發明內容

針對上述問題中的至少之一，本發明提供了一種干細胞高效表達目的蛋白的制備方法和應用方法，通過電轉染方式將重組表達載體轉移至干細胞中，從而提取得到目的蛋白外泌體，采用人源啟動子EF1A，在寡肽-1和堿性成纖維蛋白或其他蛋白N端融合CD33信號肽，有利于蛋白分泌，采用IRES表達原件可以增加兩種細胞因子的協同作用，使兩種細胞因子同時表達，采用附加體系統可以使轉移的重組表達載體質粒在干細胞內長時間存在并高效表達目的蛋白，采用PURO序列篩選標記可以迅速獲得高表達的細胞。

為實現上述目的，本發明提供了一種干細胞高效表達目的蛋白的制備方法，包括：從人體組織中分離干細胞并進行培養；結合PB轉座子、EF1A啟動子序列、KOZAK序列、所要表達的目的蛋白序列、T2A序列、所要表達目的蛋白序列、CD33信號肽序列、IRES序列、PURO序列和附加體系統，構建重組表達載體；將所述重組表達載體加入所述干細胞的培養懸液，采用電轉染方式獲得能夠表達所述目的蛋白的干細胞。

在上述技術方案中，優選地，所述重組表達載體中包括兩種目的蛋白的序列，兩種目的蛋白的序列分別設置于所述T2A序列的前后兩側。

在上述技術方案中，優選地，所述目的蛋白包括寡肽-1、堿性成纖維蛋白、角質蛋白、膠原蛋白、纖維連接蛋白、原纖蛋白、再生蛋白、轉化因子、胰島素樣生長因子和轉化因子。

在上述技術方案中，優選地，所述人體組織中分離出的所述干細胞包括間充質干細胞、脂肪干細胞和上皮干細胞，所述人體組織包括人臍帶組織和脂肪組織。

在上述技術方案中，優選地，所述電轉染方式的實施步驟包括：在電轉染實施前1-2天，將所述干細胞轉移至細胞培養瓶，使得電轉染前所述干細胞的細胞匯合度為50％-70％；采用PBS緩慢沖洗所述干細胞，再吸出所述PBS，采用胰酶蛋白酶消化所述干細胞，再加入含血清的培養基中和胰酶；離心收集所述干細胞，采用PBS、hepes和無血清培養基重懸細胞，使之密度為1×10⁶～5×10⁶cell/ml；設置電轉染參數為2.0kV、25uFD；將所述重組表達載體的質粒加入電轉杯，根據所述干細胞種類設置所述質粒的起始濃度為10～50μg/ml；向電擊杯中加入重懸后的細胞，顛轉所述電擊杯進行混勻；將所述電擊杯放入電擊槽中，進行一次脈沖電擊；將電擊后的細胞轉移至含有培養基的孔中；晃動孔板以混勻細胞，電轉24～48小時后，細胞基因瞬時表達。

在上述技術方案中，優選地，所述目的蛋白為寡肽-1和堿性成纖維蛋白時，所述重組表達載體為PB—EF1A—KOZAK—寡肽-1—T2A—堿性成纖維蛋白—CD33—IRES—PURO,附加體ORI—附加體EBNA1。