[發明專利]具有NK細胞及ADCC能力的人源化免疫系統小鼠的構建方法

在審

• 申請號: 202010291276.5
• 申請日: 2020-04-14
• 公開（公告）號: CN111485001A
• 公開（公告）日: 2020-08-04
• 發明（設計）人: 楊楠;陳潔;傅秋華;羅艷;段繼峰
• 申請（專利權）人: 澎立生物醫藥技術（上海）有限公司
• 主分類號: C12N15/864
• 分類號: C12N15/864;C12N15/24;C12N15/62;A01K67/027;A61K49/00
• 代理公司: 上海精晟知識產權代理有限公司 31253
• 代理人: 輦甲武

1.一種具有NK細胞及ADCC能力的人源化免疫系統小鼠的構建方法，其特征在于，包括：

具有人工補充外源性細胞因子IL-15的步驟。

2.如權利要求1所述的具有NK細胞及ADCC能力的人源化免疫系統小鼠的構建方法，其特征在于：

補充細胞因子IL-15的方法包括AAV載體、質粒的高壓水動力注射、FC化的長效細胞因子注射或者普通細胞因子注射。

3.如權利要求1所述的具有NK細胞及ADCC能力的人源化免疫系統小鼠的構建方法，其特征在于，包括：

步驟一：制作常規的人源化免疫系統小鼠；

步驟二：制備包裝好的AAV載體，AAV載體中包含細胞因子IL-15基因；

步驟三：向常規的人源化免疫系統小鼠體內注射包裝好的AAV載體。

4.如權利要求3所述的具有NK細胞及ADCC能力的人源化免疫系統小鼠的構建方法，其特征在于：

步驟一中，制作常規的人源化免疫系統小鼠的方法如下：

步驟1-1，選用新生小鼠，進行全身輻照清髓。射線的劑量為0.5-3Gy每只小鼠；

步驟1-2，經輻照處理后，對小鼠尾靜脈注射CD34陽性的人源造血干細胞，注射劑量為1*104～1*106每只小鼠；

步驟1-3，干細胞接種8周后，對該人源化免疫系統小鼠的外周血中人源免疫細胞的比例和亞群進行流式檢測，當外周血中人源免疫細胞占總免疫細胞數量超過15％，即能夠用于新一代人源化免疫系統小鼠的構建。

5.如權利要求3所述的具有NK細胞及ADCC能力的人源化免疫系統小鼠的構建方法，其特征在于：

步驟二中制備AAV載體的步驟如下：

步驟2-1，根據IL-15的人源基因序列進行引物設計；

步驟2-2，擴增目的基因IL-15；

步驟2-3，將目的基因構建入線性化表達載體中，形成重組質粒；

步驟2-4，制備感受態細胞；

步驟2-5，將重組后的質粒轉化到感受態細胞中；

步驟2-6，使用菌落PCR鑒定陽性轉化子；

步驟2-7，提取構建成功的質粒；

步驟2-8，將質粒包裝到AAV病毒載體中。

6.如權利要求3所述的具有NK細胞及ADCC能力的人源化免疫系統小鼠的構建方法，其特征在于：

步驟三中，尾靜脈注射包裝好的AAV病毒載體，劑量范圍為1*10⁹～2*10¹¹每只小鼠。

7.如權利要求5所述的具有NK細胞及ADCC能力的人源化免疫系統小鼠的構建方法，其特征在于：

AAV病毒包裝完成后，還具有AAV對293T細胞的表達驗證的步驟：

步驟2-10：總蛋白抽提：將病毒與293T細胞共同培養48小時后，離心洗滌并分離細胞，將細胞裂解后提取總蛋白，

步驟2-11：測蛋白濃度，

步驟2-12：樣品制備，

步驟2-13：SDS-PAGE凝膠電泳，

步驟2-14：轉膜，

步驟2-14：免疫反應，成像儀拍照。

8.如權利要求2所述的具有NK細胞及ADCC能力的人源化免疫系統小鼠的構建方法，其特征在于：

Fc化細胞因子注射的方法如下：

制備Fc化細胞因子：

步驟4-1，IL-15功能基因的克隆；

步驟4-2，人IgG Fc基因的克隆；

步驟4-3，Fc融合蛋白表達質粒的構建；

步驟4-4，將表達質粒轉入受體細胞，并篩選高表達細胞株；

步驟4-5，IL-15與Fc融合蛋白的純化：收集高表達細胞株的表達產物，分離提純；

然后將IL-15與Fc的融合蛋白注射給常規的人源化免疫系統小鼠。