[發(fā)明專利]基于二代測序技術(shù)檢測68個基因座的試劑盒及其使用的引物組合

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010284683.3
• 申請日: 2020-04-13
• 公開（公告）號: CN111286548B
• 公開（公告）日: 2022-06-21
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王樂;康克萊;張馳;季安全;葉健;楊凱潤
• 申請（專利權(quán)）人: 公安部物證鑒定中心
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12N15/11
• 代理公司: 北京紀凱知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 閆書寧

本發(fā)明公開了基于二代測序技術(shù)檢測68個基因座的試劑盒及其使用的引物組合。引物組合由120條引物組合，120條引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO：1?SEQ ID NO：120所示。相比于illumina公司的ForenSeq^TM DNA Signature PrepKit，本發(fā)明提供的試劑盒中包含41個新的Y?STR基因座，能提供更多新的遺傳信息。而且本發(fā)明提供的復(fù)合擴增體系中所有Y?STR基因座的最大擴增子長度都小于300bp，而ForenSeq^TM DNA Signature PrepKit中有約29.1％(7/24)基因座的最大擴增子長度大于300bp，不利于降解檢材的分析。實驗證明，采用本發(fā)明提供的試劑盒檢測標準品2800M中68個基因座的STR分型，分型結(jié)果準確。本發(fā)明具有重要的應(yīng)用價值。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于法醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及基于二代測序技術(shù)檢測68個基因座的試劑盒及其使用的引物組合，尤其涉及基于二代測序技術(shù)檢測67個Y-STR基因座和Amelogenin基因座的試劑盒及其使用的引物組合。

背景技術(shù)

短串聯(lián)重復(fù)(short tandem repeat，STR)是由2～6bp重復(fù)單位串聯(lián)組成且廣泛存在于人類基因組中的一類具有長度多態(tài)性的DNA序列，是目前法醫(yī)個體識別和親子鑒定應(yīng)用最廣泛的遺傳標記。人類Y染色體短串聯(lián)重復(fù)(Y-chromosome short tandem repeats，Y-STR)具有父系遺傳、缺乏重組、分型簡單、信息量大、多態(tài)性高等特點，是研究人類的起源進化、民族差異、種族差異、群體及地區(qū)分布等的有力工具。因此，Y染色體STR基因座多態(tài)性研究可為法醫(yī)學(xué)個體識別和親權(quán)鑒定提供重要手段，在諸如父系家族的親權(quán)鑒定、混合斑男性成分的檢測、不同男性個體混合物的分析、追溯父系遷移歷史及重構(gòu)同一父系家族等方向都具有獨特的應(yīng)用價值。

目前，熒光標記多重擴增結(jié)合毛細管電泳(fluorescent labeled multiplexPCR-capillary electrophoresis，PCR-CE)是STR分型的主流技術(shù)；常用的商業(yè)化Y-STR分型試劑盒有Y23(Promega)、Y(Promega)、Yfiler(ThermoFisher Scientific)和Yfiler Plus(Thermo Fisher Scientific)等。研究發(fā)現(xiàn)，基于PCR-CE分型時，相同片段長度的等位基因中存在重復(fù)區(qū)域序列結(jié)構(gòu)不一致的情況。

二代測序技術(shù)(second generation sequencing，SGS)又稱為下一代測序技術(shù)(next generation sequencing，NGS)，具有測序通量高、速度快的優(yōu)點。NGS不僅能從長度多態(tài)性上對STR基因座進行分析，還能從序列上發(fā)掘STR基因座的遺傳多態(tài)性。隨著NGS測序成本越來越低、測序讀長逐漸的增加，NGS對STR分型技術(shù)也越來越成熟。近年來，NGS技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)STR分型研究。相比于PCR-CE分型，NGS技術(shù)在Y-STR基因座的分析中具有很多優(yōu)勢：1、樣本輸入量低，使得微量樣本及降解樣本檢材的分型研究變?yōu)榭赡埽?、準確性高，能夠全部覆蓋基因座的每個堿基并通過產(chǎn)出高測序深度保證Y-STR基因座各等位基因的高概率精確判斷的嚴謹性；3、能夠獲得Y-STR等位基因間的核苷酸差異信息，由于核心重復(fù)結(jié)構(gòu)存在差異或擴增區(qū)段內(nèi)存在變異(側(cè)翼序列的堿基突變或插入缺失)，序列長度相等的等位基因可能是具有遺傳穩(wěn)定性的完全不同的等位基因，這種Y-STR序列多態(tài)性是個體識別分析的寶貴資源；4、成本低，通過對每個樣本檢材添加標簽一次可以同時對多個樣本進行平行測序，既節(jié)約時間又降低測序成本。