[發明專利]一種鼠疫耶爾森氏菌蛋白質譜庫的建立方法

在審

• 申請號: 202010280264.2
• 申請日: 2020-04-10
• 公開（公告）號: CN111554352A
• 公開（公告）日: 2020-08-18
• 發明（設計）人: 石麗媛;馮彬;王鵬;張海鵬;楊豐義;鐘佑宏;董珊珊;譚紅麗;郭英;段存娟;楊麗華;龔平花
• 申請（專利權）人: 云南省地方病防治所;珠海美華醫療科技有限公司
• 主分類號: G16B50/30
• 分類號: G16B50/30;G06F16/532;C12N1/20;C07K1/14;C12R1/01
• 代理公司: 昆明合盛知識產權代理事務所(普通合伙) 53210
• 代理人: 龍燕

本發明公開一種鼠疫耶爾森氏菌蛋白質譜庫的建立方法，屬于微生物鑒定技術領域。本發明所述方法將鼠疫耶爾森氏菌質譜圖加入到蛋白質譜儀中，并通過引入二級算法，成功的將鼠疫耶爾森氏菌和假結核耶爾森氏菌鑒別區分開，使用該方法得到的質譜儀能夠準確鑒定鼠疫耶爾森氏菌。

技術領域

本發明涉及一種鼠疫耶爾森氏菌蛋白質譜庫的建立方法，屬于微生物鑒定技術領域。

背景技術

鼠疫是由鼠疫耶爾森氏菌引起的一種自然疫源性疾病，嚴重危害人類健康。我國《傳染病防治法》將鼠疫列為甲類傳染病。歷史上，鼠疫曾發生三次世界性的大流行，造成上億人的死亡；2017年8月，非洲馬達加斯加暴發鼠疫疫情，累計報告病例2600多例，死亡200多例；2019年11月北京確診來自內蒙錫林郭勒的2例肺鼠疫病例，當月內蒙烏蘭察布又先后確診2例腺鼠疫病例。鼠疫對人類的威脅依然存在。

隨著科技的快速發展，蛋白質譜技術已廣泛應用于微生物的鑒定，而在耶爾森氏菌屬中最對人類威脅最大的鼠疫耶爾森氏菌尚未在質譜儀中建庫，不能被準確鑒定。例如由珠海美華醫療科技有限公司研發的M-Discover 100質譜檢測儀，該儀器在細菌域的庫容為5159株菌，在耶爾森氏菌屬的庫容為37株菌，包括假結核、小腸結腸炎、羅氏、魯氏等耶爾森氏菌，鼠疫耶爾森氏菌尚未在該質譜儀建庫。

鼠疫耶爾森氏菌尚未入庫的原因，一方面是鼠疫耶爾森氏菌具有高致病性，從事鼠疫耶爾森氏菌活動需要在高等級生物安全實驗室進行，因此限制了一般機構或公司獲得和使用鼠疫耶爾森氏菌，也同時限制了質譜儀鑒定鼠疫耶爾森氏菌的能力。另一方面，發明人實驗時發現，鼠疫耶爾森氏菌未建庫前，測試菌株為鼠疫耶爾森氏菌時，鑒定結果為假結核耶爾森氏菌(假結核耶爾森氏菌是與鼠疫耶爾森氏菌最近緣的種)；鼠疫耶爾森氏菌建庫后，鼠疫耶爾森氏菌能鑒定成功，但假結核耶爾森氏菌鑒定錯誤，被鑒定為鼠疫耶爾森氏菌。耶爾森氏菌屬目前有 18種，其中對人類致病的有3種：鼠疫耶爾森氏菌、假結核耶爾森氏菌及小腸結腸炎耶爾森氏菌。鼠疫耶爾森氏菌認為是從假結核耶爾森氏菌進化而來的，這兩種菌的基因組的相似度甚至超過了某些細菌種內菌株的相似度，但在細菌的致病性上有很大的差別，鼠疫耶爾森氏菌能引起腺鼠疫、肺鼠疫等，患者急性發病，在沒有有效的抗生素治療時快速死亡，肺鼠疫還能通過飛沫傳播，在沒有呼吸道防護的情況下，極易造成疾病的大面積流行。而假結核耶爾森氏菌感染，患者主要表現為腸道的感染和皮膚的紅斑和結節等。因此兩種耶爾森菌為人類的危害程度不一，一旦鑒定失敗會帶來嚴重的后果。

綜上所述，將鼠疫耶爾森氏菌蛋白質譜納入質譜儀庫容中，不僅需要有菌株來源，需要配備相應的生物安全實驗室，還存在技術難題，而如何解決鼠疫耶爾森氏菌與假結核耶爾森氏菌發生鑒定混淆的問題，如何進一步區分鼠疫耶爾森氏菌和假結核耶爾森氏菌是現有技術難題的關鍵。

發明內容

本發明的目的在于提供一種鼠疫耶爾森氏菌蛋白質譜庫的建立方法，具體包括以下步驟：

(1)選擇建庫菌株：選擇3個以上不同疫源地的菌株，每個疫源地的菌株大于等于5株，用大腸桿菌E.coliATCC8739校正質控。

(2)對選取的菌株進行復蘇、傳代、大培養，并同時進行鼠疫噬菌體裂解試驗，以確保菌株沒有污染發生，然后提取蛋白液，并將細菌蛋白液進行無菌實驗。

(3)點板及圖譜采集：無菌實驗無鼠疫耶爾森氏菌存活后，將細菌蛋白液點板；每株菌蛋白液平行點樣15個靶點，點在質控菌以外的15個靶點位置，每個靶點采集圖譜2次；如此，每株菌共產生圖譜30個。

(4)建庫：將16株鼠疫耶爾森氏菌株建庫，每株菌有30個圖譜，將圖譜疊加，剔除峰形特殊的圖譜后剩余圖譜全部入庫，系統自動生成該菌株的蛋白質譜庫。

(5)引入二級算法