[發明專利]一種采用Ala-Gln調控抗體半乳糖基化水平的方法

有效

• 申請號: 202010269042.0
• 申請日: 2020-04-08
• 公開（公告）號: CN111440225B
• 公開（公告）日: 2021-09-28
• 發明（設計）人: 靳志剛;王鑫
• 申請（專利權）人: 興盟生物醫藥（蘇州）有限公司
• 主分類號: C07K1/107
• 分類號: C07K1/107
• 代理公司: 北京精金石知識產權代理有限公司 11470
• 代理人: 尉月麗

本發明提供了一種采用Ala?Gln調控抗體半乳糖基化水平的方法。通過向表達蛋白的細胞的培養過程中添加Ala?Gln調節半乳糖修飾比例，同時保證了蛋白產量，解決了常用的降溫方法降低抗體半乳糖修飾比例同時也會降低細胞培養蛋白產量的問題。本發明提供的方法操作簡單，程序可控，適于量化生產。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種采用Ala-Gln調控抗體半乳糖基化水平的方法。

背景技術

蛋白質的糖基化是一種最常見的蛋白翻譯后修飾，是在糖基轉移酶作用下將糖類分子轉移至蛋白質特定位置。蛋白質上糖鏈的結構和組成會顯著影響蛋白的穩定性、安全性和有效性。因此，理解蛋白糖型的功效和控制糖型合成十分重要。

哺乳動物中蛋白質的糖基化類型可分為3種：N-糖基化、O-糖基化和GPI糖基磷脂酰肌醇錨。N-連接的糖鏈合成起始于內質網，完成于高爾基體。N-糖鏈合成的第一步是將一個14糖的核心寡聚糖添加到新形成多肽鏈的特征序列ASN-X-SER/THR(X代表任何一種氨基酸)的天冬酰胺上，天冬酰胺作為糖鏈受體。核心寡聚糖由2分子N-乙酰葡萄糖胺、9分子甘露糖和3分子葡萄糖依次組成，第一位N-乙酰葡萄糖胺與ER雙脂層膜上的磷酸多萜醇的磷酸基結合，當ER膜上有新多肽合成時，整個糖鏈一起轉移。寡聚糖轉移到新生肽以后，在ER中進一步加工，依次切除3分子葡萄糖和1分子甘露糖。在內質網形成的糖蛋白具有相似的糖鏈，由Cis面進入高爾基體后，在各膜囊之間的轉運過程中，發生了一系列有序的加工和修飾，原來糖鏈中的大部分甘露糖被切除，但又被多種糖基轉移酶依次加上了不同類型的糖分子，形成了結構各異的寡糖鏈。

單克隆抗體作為一種糖蛋白是非常重要的治療藥物。單克隆抗體在體內的生理活性受2種獨立的機制調節：靶向抗原并中和或者引發細胞凋亡以及抗體Fc效應功能，其中抗體Fc效應功能包括抗體依賴的細胞毒作用(ADCC)和補體依賴的細胞毒作用(CDC)。研究發現，抗體的Fc端效應功能與位于該區域的寡糖鏈有關。提高IgG抗體半乳糖修飾比例會顯著增強CDC效應。并且，半乳糖增加可能會提高抗體唾液酸化水平，唾液酸化水平增強可以提高糖蛋白血清中的半衰期；但是，半乳糖增加也會降低ADCC效應，因此，降低抗體半乳糖可能能防止ADCC效應降低。因此，需要采用合適的細胞培養方法調控抗體半乳糖基化水平至合適的水平。

單克隆抗體的糖基化可以影響蛋白藥物的藥效動力學和藥代動力學，從而增強藥物治療效果。單克隆抗體IgG的N-糖基化位點一般位于Fc端CH2結構域上的ASN-297殘基上。目前，大部分抗體藥物由中國倉鼠卵巢細胞CHO表達，采用該表達系統生產的抗體蛋白抗原性、免疫原性和功能與天然蛋白質最接近，糖基化等翻譯后修飾最準確。但是，采用該表達系統生產的抗體糖型受到細胞培養方法影響展現出多樣性，從而可能影響抗體蛋白FC效應功能。

在生物類似藥開發過程中，抗體質量要求與原研藥可比，糖型屬于抗體的關鍵質量屬性，需要將所開發的生物類似藥糖型調控至與原研藥可比。目前，通過細胞培養獲得的抗體蛋白半乳糖修飾比例高于原研藥，細胞培養方法對抗體糖型調控有顯著影響。細胞培養的細胞株、工藝參數以及培養基成分均影響單克隆抗體的糖基化。有研究采用基因工程策略改變糖型合成過程中涉及的糖基轉移酶基因，也有研究對表達的蛋白在體外進行修飾。細胞培養工藝參數pH、溫度、pCO₂會影響抗體糖型。其中，采用降溫方法來降低半乳糖修飾比例是比較常用的方法。但是采用降溫方法降低抗體半乳糖修飾比例同時也會降低細胞培養蛋白產量。

Ala-Gln主要用于細胞培養，具有提高細胞培養密度、細胞活率和表達量的作用，Ala-Gln調節抗體半乳糖修飾比例的方法尚未見報道。

發明內容

為了解決上述問題，本發明通過優化Ala-Gln添加濃度，達到調控半乳糖修飾比例的目的，同時保證了抗體表達量。

術語：本發明中糖指的是單糖或者多糖。

本發明中描述的糖蛋白指的是具有糖鏈的蛋白或者多肽，因此，凡是蛋白質或多肽上連接有糖鏈的均定義為糖蛋白。