[發明專利]一種過表達vault RNA 2-1基因質粒構建方法及其應用

有效

• 申請號: 202010260686.3
• 申請日: 2020-04-03
• 公開（公告）號: CN111593069B
• 公開（公告）日: 2022-11-08
• 發明（設計）人: 馬祥雪
• 申請（專利權）人: 中國中醫科學院西苑醫院
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/66;A61K48/00;A61P35/00
• 代理公司: 北京金恒聯合知識產權代理事務所 11324
• 代理人: 李強

發明公開了一種針對vault RNA 2?1基因過表達重組質粒的構建方法及其在基因功能研究方面的應用。本發明涉及一種vault RNA 2?1基因，并提供vault RNA 2?1基因過表達重組真核表達質粒pcDNA3.1(+)?vtrna2?1構建方法，以及在人結腸癌細胞中vault RNA 2?1基因研究的實驗方法。

技術領域：

本發明涉及一種過表達vault RNA 2-1真核重組表達質粒的構建方法及其應用。

技術背景

結直腸癌(colorectal cancer,CRC)是消化道常見惡性腫瘤之一，其發病率在全球居于惡性腫瘤第3位，死亡率高居第2位，是占全球發病和死亡首位的消化系統惡性腫瘤，嚴重威脅生命健康。近年來隨著我國生活方式及飲食結構的西化，結直腸癌發病率總體呈現上升趨勢，已成為我國消化系統發病率第2位、患病率第1位的惡性腫瘤。2018年預計我國結直腸癌新發病例超過52.1萬，死亡病例約24.8萬，新發和死亡病例均接近全世界同期結直腸癌病例的30％，疾病負擔沉重。目前我國結直腸癌5年生存率遠低于美國及日韓，85％以上的結直腸癌發現即已屬晚期，即使經過手術、放化療、靶向治療等綜合治療，患者的5年生存率仍明顯低于40％；相反，早期結直腸癌治療后5年生存率可超過95％，甚至可以完全治愈。因此，早期診斷、早期治療CRC尤為重要。目前，結直腸癌瘤的早期發生的分子機制尚未完全闡明，因此，深入了解結直腸癌的分子機理，對于研究開發癌癥早期診斷治療有重要作用。

基因工程，又稱為基因重組技術，是二十世紀七十年代發展起來的在體外對DNA進行操作的一門技術，廣泛用于疾病基礎研究、基因治療、基因免疫、基因疫苗等，其三要素分別為：酶、目的基因與載體。而真核表達載體是基因工程中用于構建真核基因表達系統的一種載體。近幾十年來，各國學者圍繞真核表達載體進行了各種疾病、基因等相關研究，在基因工程方面做了大量工作，為醫學科學研究開辟了嶄新途徑。

非編碼RNA是近年來出現的腫瘤發生發展的關鍵分子，其臨床價值正受到密切關注。Vault RNA(vtrna)是一類84-141nt長的真核非編碼RNA，由RNA聚合酶III轉錄。它們與形成穹窿顆粒的保守的穹窿蛋白相聯系，這是一種復雜的結構，其在癌癥中的功能和相關性至今仍不為人所知。人類vtrna家族包含vtrna1-1，vtrna1-2，vtrna1-3以及vtrna2-1四個亞型。不同的證據表明，vtrna2-1的表觀遺傳控制是復雜的，可能具有臨床意義。乳腺癌、肺癌、結腸癌、膀胱癌、食道癌和胃癌的獨立報告顯示，其啟動子在腫瘤組織中的甲基化程度與正常組織不同。

發明內容

本發明運用基因重組技術，針對vtrna2-1基因，構建重組真核表達載體pcDNA3.1(+)-vtrna2-1，并將其轉染人結腸癌上皮細胞，構建轉染vtrna2-1基因的細胞株，為研究vtrna2-1基因功能提供良好的工具，亦為進一步研究vtrna2-1在結直腸癌的生物學功能奠定基礎，同時為研究人結直腸癌或其他惡性腫瘤中vtrna2-1基因功能提供有效實驗方法。

根據本發明的一個方面，本發明人提供了一種新穎的真核重組質粒及其制備方法，并證明了所述重組質粒是能夠用于vtrna2-1基因功能研究的良好工具，并為研究人結直腸癌vtrna2-1基因功能提供有效實驗方法。

vtrna2-1基因已在GenBank注冊，注冊號NG_051612.1，定位于5q31.1，全長108bp。本發明所述的真核重組質粒，其制備方法依次包括以下的步驟：

A)通過RT-PCR合成人的vtrna2-1基因片段；

B)將上述獲得的核苷酸片段與真核質粒連接，該插入片段的酶切位點分別為HindIII和XhoI，將上述真核重組質粒轉化到感受態細菌中培養，篩選正確插入的真核重組質粒克隆；

C)抽提真核重組質粒，利用限制性內切酶酶切圖譜分析所建真核重組質粒。