[發明專利]牛卵母細胞體外成熟方法和所用的成熟液

有效

• 申請號: 202010250267.1
• 申請日: 2020-04-01
• 公開（公告）號: CN111235096B
• 公開（公告）日: 2022-05-20
• 發明（設計）人: 郭晶;王小武;王娜;張月橋;郝少強;趙明禮;郭春明;許曉椿
• 申請（專利權）人: 天津力牧生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/075
• 分類號: C12N5/075
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種成熟培養液，其組成為：20mg/L辛酸鈉、2.5mg/L聚維酮K30、10%發情牛血清、26.2mmol/L的NaHCO3、10μmol/L的EGCG、5mmol/L的4-羥乙基哌嗪乙磺酸、1μg/mL雌二醇、3%牛卵泡液、10μg/mL黃體生成素、100μmol/L半胱氨酸、10μg/mL卵泡刺激素、TCM-199加至100%。

2.一種牛卵母細胞體外成熟的方法，該方法包括如下步驟：

(1)提供卵母細胞，其是照包括如下步驟的牛活體采卵方法采集得到的：

i、取卵前的超排處理

篩選兩側卵巢上直徑2~8mm的卵泡數≥20的牛，作為卵母細胞供體牛，牛齡為2~5歲；在兩天內分4次等劑量注射FSH制劑進行超排，每次注射間隔12h，每次注射劑量以FSH計為0.5μg/kg牛體重；

ii、活體采卵

在末次注射FSH制劑48小時后，進行活體采卵，活體采卵操作如下：

(ii1)術前準備：調試設備至工作狀態，吸卵真空泵的壓力為50-90mmHg，收集管中注入5ml吸卵液，置衡溫器中，衡溫器溫度調至39℃；用透明塑料導管連接取卵針針尾和收集管塞上的一個接口，收集管塞的另一接口與真空泵相連；動物站立穩定，清除直腸糞便，消毒外陰，用2-4ml的20%利多卡因進行尾間隙硬膜外腔神經干傳導阻斷麻醉，待尾根松軟后進行操作；

(ii2)卵巢及卵泡的觀察：操作人員一手握住B超探頭柄部，將其輕緩插入陰道穹隆處，另一手伸入直腸，從直腸握住卵巢，將其置于探頭上，移動卵巢，通過B超屏幕觀察卵巢的結構和大小，區分卵泡和黃體，詳細記錄卵泡的數目和大小；在B超屏幕上，卵巢呈弱回聲結構，輪廓清晰；卵泡在卵巢區域內呈多個無回聲區，輪廓清楚，可以進行采卵；

(ii3)取卵：移動卵巢使將要穿刺的卵泡位于B超顯示屏取卵線上，吸卵針內吸滿吸卵液，將其插入探頭背部的穿刺針固定筒中，針頭刺破陰道壁和卵泡壁，同時，用腳踏開關控制真空泵，吸取卵泡內容物至收集管中；重復穿刺幾個卵泡后，及時抽出穿刺針，從針頭吸入適量的吸卵液沖洗針管，以防被凝固的血液堵塞，沖洗液一同收至收集管中，得到卵泡液；

iii、卵母細胞的檢出

將采集的卵泡液立即用洗卵液稀釋，倒入胚胎濾器中，反復洗滌3-4次，最后將濾器中的液體及沉淀物倒入培養皿中，在解剖鏡下檢出采集的卵母細胞數，并計數具有如下性狀的作為可用卵母細胞的卵母細胞數目即可用卵數：卵母細胞的細胞質均勻、COCs包裹有不少于兩層卵丘細胞，至少有5層以上顆粒細胞，且致密地排列于卵母細胞周圍；

(2)卵母細胞的體外成熟：使所述卵母細胞移入成熟培養液滴中，進行體外成熟培養，培養條件為100%濕度、38.5°C、5%CO2，體外成熟培養22~24h；

其中，所述成熟培養液的組成為：20mg/L辛酸鈉、2.5mg/L聚維酮K30、10%發情牛血清、26.2mmol/L的NaHCO3、10μmol/L的EGCG、5mmol/L的4-羥乙基哌嗪乙磺酸、1μg/mL雌二醇、3%牛卵泡液、10μg/mL黃體生成素、100μmol/L半胱氨酸、10μg/mL卵泡刺激素、TCM-199加至100%。

3.根據權利要求2的方法，其中牛活體采卵方法中所用的FSH制劑組成為：卵泡刺激素35μg/ml、雌三醇、0.4mg/ml泊洛沙姆188；其中卵泡刺激素：雌三醇=100：15。

4.根據權利要求2的方法，其中供體牛為中國黃牛。

5.根據權利要求2的方法，其中供體牛為日本和牛。

6.根據權利要求2的方法，其中發情牛血清是照包括如下步驟的方法制備得到的：采血品種為雌性牛，選擇處于發情狀態的個體，進行頸靜脈采血，用50mL滅菌的一次性離心管傾斜30~45°沿管壁收集；在采血當地常溫靜置，待觀察到血樣凝固后送回實驗室，避免陽光照射，室溫靜置4~6h，可以觀察到分層，上層析出部分血清，避免晃動；12h后離心并收集血清；血清被置于56°C水浴中滅活30min，用一次性15mL離心管根據每次用量分裝；每次使用解凍一小管，避免反復凍融，造成血清質量下降。