[發明專利]酮還原酶、核酸、重組表達質粒及菌株、合成勞拉替尼中間體中的應用

在審

• 申請號: 202010248056.4
• 申請日: 2020-04-01
• 公開（公告）號: CN111411116A
• 公開（公告）日: 2020-07-14
• 發明（設計）人: 王海濤;葛德培;吳其華
• 申請（專利權）人: 安徽聯創生物醫藥股份有限公司
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N9/02;C12N15/70;C12N1/21;C12P7/22;C12R1/19
• 代理公司: 合肥兆信知識產權代理事務所(普通合伙) 34161
• 代理人: 胡慧

1.一種酮還原酶，為如下的(a)、(b)或(c)：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的多肽；

(b)在(a)基礎上突變n個氨基酸、缺失或添加m個氨基酸的具有(a)活性的多肽；其中，1≤n≤10，1≤m≤30；

(c)與(a)具有至少90％同一性且具有(a)活性的多肽。

2.編碼權利要求1所述酮還原酶的核酸，其DNA序列如SEQ ID NO:1所示。

3.包含權利要求2所述核酸的重組表達質粒。

4.根據權利要求3所述的重組表達質粒，其中，所述核酸選用pET21a載體構建重組表達質粒。

5.包含權利要求3或4所述重組表達質粒的重組表達菌株。

6.根據權利要求5所述的重組表達菌株，其制備方法包括以下步驟：

1)將所述重組表達質粒轉化到宿主細胞，涂布在含有50μg/mL氨芐的LB平板上，37℃過夜培養后，從中挑選陽性菌落接種到50mL液體LB培養基中進行培養；培養4h后，吸取10mL種子液轉入1L新鮮的LB液體培養基；

2)當培養的濃度達到OD₆₀₀ 0.6-1.0時，加入終濃度為0.05-1.0mmol/L的異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷進行誘導，誘導溫度為16-30℃，誘導培養為8-16h，誘導培養后離心或濃縮，得到重組表達菌株的濕菌體。

7.根據權利要求6所述的重組表達菌株，其中，所述宿主細胞為大腸桿菌E.coliBL21。

8.權利要求1所述酮還原酶在合成(S)-1-(2-碘-5-氟苯基)乙醇中的應用。

9.根據權利要求8所述的應用，其中，所述合成的方法為：在純水相體系下，在pH 6.0-8.0的緩沖液中，在葡萄糖、葡萄糖脫氫酶和輔酶存在下，所述酮還原酶對前體羰基化合物進行不對稱還原反應形成(S)-1-(2-碘-5-氟苯基)乙醇，所述前體羰基化合物為2-碘-5氟苯乙酮，所述輔酶為NADP輔酶。

10.根據權利要求9所述的應用，其中，所述方法包括以下步驟：

1)將權利要求6或7所述重組表達菌株的濕菌體破碎，得到酮還原酶的粗酶裂解液；

2)在緩沖液中加入粗酶裂解液、葡萄糖脫氫酶、葡萄糖、輔酶以及前體羰基化合物，在25-35℃溫度下反應，用碳酸鈉控制pH，用TLC點板檢測反應完全；

3)過濾除蛋白，用等體積乙酸乙酯萃取水相和洗滌濾餅兩次；

4)合并有機相，減壓回收溶劑，即得(S)-1-(2-碘-5-氟苯基)乙醇；

所述粗酶裂解液的用量為5000-20000U/L；所述前體羰基化合物在反應液中的濃度為50-200g/L；所述葡萄糖脫氫酶的用量為5000-20000U/L；所述葡萄糖的用量為80-300g/L；所述輔酶的用量為0.1-0.5g/L。