[發明專利]一種檢測糞便及腸道組織中腸堿性磷酸酶IAP的方法

有效

• 申請號: 202010246918.X
• 申請日: 2020-03-31
• 公開（公告）號: CN111289456B
• 公開（公告）日: 2023-04-07
• 發明（設計）人: 劉陽;陳碩;曹罡;黎一鳴
• 申請（專利權）人: 西安交通大學第二附屬醫院
• 主分類號: G01N21/31
• 分類號: G01N21/31;G01N1/38
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責任公司 61200
• 代理人: 王艾華

本發明公開了一種檢測糞便及腸道組織中腸堿性磷酸酶IAP的方法，利用對溴四咪唑草酸及L?苯丙氨酸對堿性磷酸酶和腸堿性磷酸酶的抑制作用，通過檢測堿性磷酸酶家族對對硝基苯磷酸二鈉的還原性原理，配置三種不同的檢測溶液，在檢測后進行公式計算，最后計算得出標本中的腸堿性磷酸酶含量。本發明可以排除標本中混雜的堿性磷酸酶家族其他同工酶對結果的影響，從而使檢測結果更加精確、可靠。

技術領域

本發明屬于生物酶檢測技術領域，具體涉及一種定量檢測糞便及腸道組織勻漿標本中腸道堿性磷酸酶(IAP)活性含量的方法，通過酶催化作用并配合使用酶抑制劑，從而更加精確的檢測IAP含量。

背景技術

IAP在人體內分布于從十二指腸到大腸的全部胃腸道，是一種由腸上皮細胞合成的磷酸水解酶。空腹狀態下，IAP錨定與腸上皮細胞的極性面，于進食后釋放入腸道內作用。IAP的作用主要主要包括：1、水解內毒素的磷酸基團，從而解毒腸道細菌的內毒素；2、可以通過維持腸上皮細胞間的緊密連接而維持腸道屏障功能，從而抑制腸道細菌移位所誘發的全身炎癥；3、能夠維持正常的腸道細菌微生態平衡。而IAP的降低也被發現同腸道多種炎癥因子表達程負相關。因此糞便及腸道組織中IAP含量，也被認為是評價腸屏障損傷及腸道炎癥的重要指標之一，并在炎性腸病、代謝綜合癥、高脂飲食、酒精攝入等情況所致的腸屏障受損及慢性炎癥時降低。

IAP隸屬于堿性磷酸酶家族，包括組織非特異性堿性磷酸酶(ALP)，腸道堿性磷酸酶，胎盤堿性磷酸酶及生殖細胞堿性磷酸酶。其不同的堿性磷酸酶分布位置不同，發揮的作用也不盡相同。其中糞便及腸道組織中含有的堿性磷酸酶絕大多數為IAP，此外還含有少量的ALP。腸道中的ALP主要來自于肝臟產生分泌，并經膽汁排泄進入腸道。此外大腸上皮細胞也被發現可以產生少量的ALP。

但是現有的對腸道標本中IAP檢測方法主要通過對硝基苯磷酸二鈉方法檢測，該方法為檢測所有堿性磷酸酶的方法，僅能同時檢測標本中的ALP和IAP。由于大多數情況下ALP在糞便及腸道組織中含量較少且活性固定，因此有人將該檢測結果認為是IAP活性。但在某些生理、病例情況下(如肝臟及膽道病變時)，標本中的ALP濃度可能出現變化，因此，傳統的方法并不能精確提示標本中IAP含量。本發明針對該問題，對傳統的方法進行改進，從而能夠更加精確的檢測標本中IAP的含量。

發明內容

針對現有腸道標本IAP技術中，無法排除ALP的混雜因素而無法精確檢測IAP的濃度這一問題，本發明目的在于提供一種精確檢測腸道源標本(糞便及腸道組織)中IAP的方法。通過應用對硝基苯磷酸二鈉和標本的酶反應，同時應用IAP和ALP的特異性酶抑制劑，應用檢測反應體系的OD值實現對IAP的更加精確的檢測。

本發明提供了一種定量檢測IAP活性的方法，其包括如下檢測溶液的配制及以下步驟：

檢測溶液1配方：100mM?Tris鹽酸(pH?8.0)、1M氯化鎂、10mM氯化鋅、1.86g/L對硝基苯磷酸二鈉、水；

檢測溶液2配方：100mM?Tris鹽酸(pH?8.0)、1M氯化鎂、10mM氯化鋅、1.86g/L對硝基苯磷酸二鈉、水、對溴四咪唑草酸10mM；

檢測溶液3配方：100mM?Tris鹽酸(pH?8.0)、1M氯化鎂、10mM氯化鋅、1.86g/L對硝基苯磷酸二鈉、水、L-苯丙氨酸10mM；

檢測標本預處理：檢測標本應用水或PBS稀釋10～50倍，震蕩混勻后并離心后獲得上清溶液。

在3個不同的檢測孔中分別按照1：7比例加入檢測樣本，和3個不同檢測溶液。

在另外一個檢測孔中，按梯度加入不同濃度的IAP標準液1份及7份的檢測溶液1。

分別在加入檢測液后分別在兩個不同時間點分別檢測405nm的OD值。