[發(fā)明專利]一種嵌合抗原受體T細(xì)胞的制備方法有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 202010244429.0 | 申請日： | 2020-03-31 |
| 公開（公告）號： | CN111378690B | 公開（公告）日： | 2022-04-05 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 唐東起;李世武;楊木;張文;劉江 | 申請（專利權(quán)）人： | 山東大學(xué)第二醫(yī)院 |
| 主分類號： | C12N15/867 | 分類號： | C12N15/867;C12N5/10;C12N15/62 |
| 代理公司： | 濟(jì)南金迪知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 37219 | 代理人： | 劉文容 |
| 地址： | 250033 山東*** | 國省代碼： | 山東;37 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 嵌合 抗原 受體 細(xì)胞 制備 方法 | ||
1.一種嵌合抗原受體T細(xì)胞的制備方法，包括步驟如下：
嵌合抗原受體慢病毒質(zhì)粒的構(gòu)建；
慢病毒的制備；
原代CD3+T細(xì)胞的篩選；
原代CD3+T細(xì)胞的感染，感染后即得嵌合抗原受體T細(xì)胞；所述感染是將慢病毒與原代CD3+T細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，所述共培養(yǎng)的時間為4～10小時，共培養(yǎng)結(jié)束后即得嵌合抗原受體T細(xì)胞；
經(jīng)感染后得到的嵌合抗原受體T細(xì)胞直接回輸至體內(nèi)。
2.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述嵌合抗原受體慢病毒質(zhì)粒是將嵌合抗原受體基因與慢病毒表達(dá)載體經(jīng)雙酶切、連接后得到的。
3.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述慢病毒表達(dá)載體為pLVX-IRES-Puro質(zhì)粒或Lenti-EF1-EGFRvIII質(zhì)粒。
4.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述慢病毒是將嵌合抗原受體慢病毒質(zhì)粒與輔助質(zhì)粒混合后轉(zhuǎn)染293ft細(xì)胞培養(yǎng)得到的。
5.如權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述輔助質(zhì)粒為psPAX2質(zhì)粒和pMD2.G質(zhì)粒。
6.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述原代CD3+T細(xì)胞是從血液外周血單個核細(xì)胞中采用CD3+T細(xì)胞分選磁珠篩選得到。
7.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述慢病毒的MOI值為15～25。
8.一種靶向CD19的嵌合抗原受體T細(xì)胞的制備方法，包括步驟如下：
(1)全基因合成靶向CD19的嵌合抗原受體基因，所述靶向CD19的嵌合抗原受體基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，將靶向CD19的嵌合抗原受體基因與慢病毒表達(dá)載體pLVX-IRES-Puro質(zhì)粒經(jīng)雙酶切、連接后得到靶向CD19的嵌合抗原受體慢病毒質(zhì)粒；
(2)將步驟(1)的靶向CD19的嵌合抗原受體慢病毒質(zhì)粒與輔助質(zhì)粒psPAX2質(zhì)粒、pMD2.G質(zhì)粒混合后轉(zhuǎn)染293ft細(xì)胞培養(yǎng)得到慢病毒；
(3)從血液樣本的外周血單個核細(xì)胞中采用CD3+T細(xì)胞分選磁珠篩選得到原代CD3+T細(xì)胞；
(4)將步驟(2)中的慢病毒與步驟(3)的原代CD3+T細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，所述共培養(yǎng)的時間為4～10小時，共培養(yǎng)結(jié)束后即得靶向CD19的嵌合抗原受體T細(xì)胞；所得嵌合抗原受體T細(xì)胞直接回輸至體內(nèi)。
9.一種靶向CD20的嵌合抗原受體T細(xì)胞的制備方法，包括步驟如下：
1)全基因合成靶向CD20的嵌合抗原受體基因，所述靶向CD20的嵌合抗原受體基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，將靶向CD20的嵌合抗原受體基因與慢病毒表達(dá)載體pLVX-IRES-Puro質(zhì)粒經(jīng)雙酶切、連接后得到靶向CD20的嵌合抗原受體慢病毒質(zhì)粒；
2)將步驟1)的靶向CD20的嵌合抗原受體慢病毒質(zhì)粒與輔助質(zhì)粒psPAX2質(zhì)粒、pMD2.G質(zhì)粒混合后轉(zhuǎn)染293ft細(xì)胞培養(yǎng)得到慢病毒；
3)從血液樣本的外周血單個核細(xì)胞中采用CD3+T細(xì)胞分選磁珠篩選得到原代CD3+T細(xì)胞；
4)將步驟2)中的慢病毒與步驟3)的原代CD3+T細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，所述共培養(yǎng)的時間為4～10小時，共培養(yǎng)結(jié)束后即得靶向CD20的嵌合抗原受體T細(xì)胞；所得嵌合抗原受體T細(xì)胞直接回輸至體內(nèi)。
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