[發明專利]高效分離純化重組人凝血因子VIII Fc融合蛋白的方法

在審

• 申請號: 202010242530.2
• 申請日: 2020-03-31
• 公開（公告）號: CN113461827A
• 公開（公告）日: 2021-10-01
• 發明（設計）人: 賈世香;徐時東;俞靈菊;周波;吳洪;袁永龍;李強
• 申請（專利權）人: 安源醫藥科技（上海）有限公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C07K1/22;C07K1/20;C07K1/18
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本發明公開了一種高效分離純化重組人凝血VIII因子Fc融合蛋白的方法。所述方法包括親和層析以及陰離子交換層析步驟；并且所述親和層析捕獲樣品在pH 4.0至8.0條件下，采用含5?20％多元醇類有機溶劑的鹽離子緩沖液進行洗脫，蛋白樣品經一步ProteinA親和層析分離即可提純至85％以上；所述純化方法操作簡便，每步層析之間自然銜接，回收率高、成本低且容易放大生產。

技術領域

本發明涉及Fc融合蛋白純化領域；更具體地，涉及一種高效分離純化重組人凝血因子VIII Fc融合蛋白的方法。

背景技術

凝血因子VIII(FVIII)是多結構的大分子糖蛋白，分為6個結構域：三個A結構域(A1、A2、A3)，一個富碳水化合物且非必需的中央結構域(B-結構域)和兩個C結構域(C1、C2)。成熟的蛋白質由大約分子量為280kDa的輕鏈和重鏈組成。輕鏈分子量約為80kDa，結構包括A3，C1和C2，連接方式為A3-C1-C2。重鏈分子量約90至200kDa，結構包括A1，A2和B，連接方式為A1-A2-B。重鏈和輕鏈連接是金屬離子依賴性的。在血漿中，重鏈和輕鏈的二聚體再以高親和力結合馮.維勒布蘭德因子(von Willebrand,vWF)，保護其免于成熟前降解。

目前，凝血因子VIII的純化工藝普遍存在工藝復雜、成本高、純度低的問題(Stefan Winge等,Protein Expression and Purification,2015,115:165-175)。親和層析過程有效去除雜質是下游蛋白制備中的關鍵因素，然而目前FVIII親和層析純化步驟多存在回收率低和成本較高的問題，親和層析在洗脫步驟中使用大量昂貴試劑，如乙二醇、丙二醇、精氨酸等，這使得填料的使用壽命縮短，有機溶劑殘留較多，回收率降低，且大大增加了純化成本。雖然GE公司開發出新型純化填料VIII select(Justin T.McCue等,Journalof chromatography A,2009,1216:7824-7830)，但仍存在填料成本較高、回收率低以及洗脫液中使用的試劑昂貴等問題。目前已申報IND或已上市的長效人凝血VIII因子的藥物生產廠家，例如，輔仁、Biogen等開發的重組人凝血因子VIII長效產品的純化工藝依舊存在操作繁瑣、成本高及回收率低等問題。

全球現有大量罹患血友病A患者，還有許多未被診斷或登記，市場需求遠遠大于產能，而重組人凝血因子VIII Fc融合蛋白的高價格使得藥物無法普及應用，而生產成本又是重組蛋白藥物價格一直居高不下的主要因素。因此，本領域亟待開發一種高效便捷、成本低廉且適于工業應用的純化重組人凝血因子VIII Fc融合蛋白的新方法。

發明內容：

本發明的目的在于建立一種操作簡便、回收率高、生產成本低的純化重組人凝血因子VIIIFc融合蛋白方法。

本發明提供一種分離或純化重組人凝血因子VIII Fc融合蛋白(簡稱融合蛋白)的方法，該方法包括以下步驟：

(1)親和層析：用蛋白A親和介質捕獲融合蛋白，再以洗脫緩沖液洗脫融合蛋白，收集分離產物；

(2)陰離子交換層析：將上述分離產物加載于季銨鹽類強陰離子交換層析介質上以分離結構變異體、聚體、去除HCP、DNA等污染物，以洗脫緩沖液進行梯度洗脫，收集分離產物；

其中，所述融合蛋白是由天然人FVIII或B結構域缺失的/截短的人FVIII及其變體通過肽接頭與來源于人的任何抗體同種型的恒定區序列(Fc結構域)或其變體融合而成；所述Fc結構域選自例如人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE的重鏈恒定區或其變體；更優選自人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的重鏈恒定區或其變體；本發明的一優選實施例中，所述重組人凝血因子VIII Fc融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。