[發(fā)明專利]抗人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1的納米抗體B3及其制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010227938.2
• 申請(qǐng)日: 2020-03-27
• 公開（公告）號(hào): CN111440239B
• 公開（公告）日: 2022-07-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張建民;王玥;陳慧;胡瑜;許依;何維
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所
• 主分類號(hào): C07K16/28
• 分類號(hào): C07K16/28;C12N15/13;C12N15/70;C12N1/21;A61K39/395;A61P35/00;C12R1/19
• 代理公司: 北京尚誠知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11322
• 代理人: 葉占洋;魯兵

本發(fā)明公開了一種抗人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1的納米抗體B3及其制備方法和應(yīng)用，屬于生物制藥領(lǐng)域。提供的制備方法采用噬菌體展示技術(shù)和生物淘篩技術(shù)篩選出與抗原具有較高結(jié)合力的抗人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1的納米抗體。該納米抗體能夠特異性地和天然TGF?β1蛋白的三種形式：LAP前體、TGF?β1單體及二聚體進(jìn)行結(jié)合，并且具有特異性強(qiáng)和親和力高的特點(diǎn)，能夠有效中和腫瘤微環(huán)境中自分泌或旁分泌TGF?β1，為腫瘤的免疫治療、促進(jìn)傷口愈合以及促進(jìn)組織修復(fù)和胚胎發(fā)育等方面提供一種基因工具。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域，涉及一種抗人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1的納米抗體及其制備方法應(yīng)用，具體涉及一種對(duì)人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1具有高特異性識(shí)別和高親和力的抗人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1的納米抗體及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和免疫功能的細(xì)胞因子之一。目前人類TGF-β超家族有TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β1β2四個(gè)成員，其中TGF-β1兼具調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖分化、控制細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的合成與降解等功能，其還可參與胚胎與骨骼的發(fā)生、組織重塑和傷口愈合等過程。然而，在腫瘤惡性進(jìn)展期間，幾乎所有腫瘤細(xì)胞內(nèi)可監(jiān)測(cè)到TGF-β1的高度活化表達(dá)，其作用由抑癌轉(zhuǎn)為促癌。臨床上，腫瘤患者血清中TGF-β1的水平與腫瘤惡性程度及預(yù)后也密切相關(guān)。TGF-β1與其受體結(jié)合后，能通過加速血管生成和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、增強(qiáng)基質(zhì)修飾等方式促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)及侵襲轉(zhuǎn)移；TGF-β1信號(hào)通路還可阻止T細(xì)胞分化成細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞、降低樹突狀細(xì)胞的抗原呈遞能力、抑制IFN-γ和TNF-α的產(chǎn)生等。由此可見，TGF-β1能抑制抗腫瘤免疫應(yīng)答，在腫瘤免疫逃逸過程中扮演著重要角色，故通過中和抗體封閉TGF-β1是腫瘤免疫治療的關(guān)鍵點(diǎn)之一。

已有研究表明，靶向TGF-β1信號(hào)通路的封閉抗體，如抗TGF-β1抗體Fresolimumab(GC1008)、抗TGF-β1受體抗體Lapatimab(AB0213)等，可以顯著減少腫瘤基質(zhì)蛋白的合成和成纖維細(xì)胞的數(shù)量，進(jìn)而抑制腫瘤的生長(zhǎng)和遷移；然而現(xiàn)有大部分完整抗體存在免疫原性高、溶解性差、易沾粘聚集和易被蛋白酶降解等缺點(diǎn)，限制了這類蛋白抗體在封閉TGF-β1進(jìn)而抑制腫瘤生長(zhǎng)和遷移中的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題的一個(gè)或多個(gè)，本發(fā)明一個(gè)方面提供一種對(duì)人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1具有高特異性和高親和力的抗人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1的納米抗體，所述納米抗體B3的氨基酸序列包含序列表中SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列，且所述納米抗體能夠特異性識(shí)別并結(jié)合TGF-β1的三種形式：LAP前體、TGF-β1單體及二聚體。

本發(fā)明另一方面提供了編碼上述的納米抗體的氨基酸序列的核苷酸編碼序列。

上述核苷酸編碼序列如序列表中SEQ ID NO：11所示或在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID NO：11所示的DNA序列雜交的核苷酸序列；所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃條件下雜交并洗膜。

本發(fā)明又一方面提供一種含有上述的核苷酸編碼序列的表達(dá)載體。

上述表達(dá)載體為將上述的核苷酸編碼序列插入pGEX6P.1原核表達(dá)載體中獲得。

含有上述的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞也屬于本發(fā)明的內(nèi)容，所述宿主細(xì)胞包括但不限于大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。

本發(fā)明再一方面提供一種腫瘤治療藥物，其包含上述的納米抗體和/或上述的核苷酸編碼序列和/或上述的表達(dá)載體和/或上述的宿主細(xì)胞；

優(yōu)選地，所述腫瘤治療藥物還包含藥學(xué)上可接受的載劑，所述藥學(xué)上可接受的載劑包括但不限于：細(xì)胞毒素、放射性同位素、免疫調(diào)節(jié)劑、抗血管生成劑、抗增殖劑、促凋亡劑、化學(xué)治療劑或治療性核酸的治療劑。

上述腫瘤包括但不限于：肺癌、卵巢癌、乳腺癌、淋巴瘤、宮頸癌、肝癌、胃癌、膠質(zhì)瘤。