[發(fā)明專(zhuān)利]基于密碼子偏好性利用點(diǎn)突變抑制變異鏈球菌毒力的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010217882.2
• 申請(qǐng)日: 2020-03-25
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111363742B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-06-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 任彪;王崢;程磊;周學(xué)東
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 四川大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/11
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/11;C12N15/10;C12N1/21;C12R1/46
• 代理公司: 北京華智則銘知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11573
• 代理人: 姜子朋

本發(fā)明屬于基因突變技術(shù)領(lǐng)域，公開(kāi)了一種基于密碼子偏好性利用點(diǎn)突變抑制變異鏈球菌毒力的方法，選取一段包含點(diǎn)突變位點(diǎn)的序列作為靶基因；將upstream、IFDC2、downstream片段融合；將融合片段轉(zhuǎn)入變異鏈球菌中，利用含紅霉素的BHI瓊脂平板進(jìn)行陽(yáng)性克隆篩選及PCR驗(yàn)證；將包含upstream、靶基因、downstream的序列分為前后兩部分；將擴(kuò)增出的mutant?upstream和mutant?downstream片段融合；將融合片段mutant up?down轉(zhuǎn)入獲得的陽(yáng)性克隆菌株中，利用含p?Cl?Phe的BHI平板進(jìn)行二次篩選及測(cè)序驗(yàn)證。本發(fā)明步驟簡(jiǎn)便，成本低，可重復(fù)性高。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因突變技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種基于密碼子偏好性利用點(diǎn)突變抑制變異鏈球菌毒力的方法。

背景技術(shù)

目前，齲病是除冠心病、癌癥之后，世界衛(wèi)生組織列明的三大非傳染性慢性病之一。第四次中國(guó)口腔健康流行病學(xué)調(diào)查報(bào)告顯示，乳牙和年輕恒牙齲病患病水平呈明顯上升趨勢(shì)，防治齲病已成為加強(qiáng)我國(guó)人群口腔健康的重點(diǎn)項(xiàng)目。齲病本質(zhì)是由微生物感染所致的牙體硬組織破壞性疾病，變異鏈球菌(Streptococcus mutans)是目前公認(rèn)的主要致齲微生物之一，其致齲毒力機(jī)制主要包括對(duì)牙面的黏附、利用糖類(lèi)產(chǎn)生多糖以及較強(qiáng)的產(chǎn)酸和耐酸能力。變異鏈球菌對(duì)牙面的黏附是其定植、致齲的基礎(chǔ)，其中葡糖基轉(zhuǎn)移酶(glucosyl transferase，GTF)是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)之一。大多數(shù)變異鏈球菌含有至少3種GTF基因，即gtfB、gtfC、gtfD。gtfB編碼的GTF-I合成水不溶性葡聚糖(insoluble glucans，IG)，gtfC編碼的GTF-SI合成IG和水溶性葡聚糖(soluble glucans，SG)的混合物，gtfD編碼的GTF-S合成SG。此外，與變異鏈球菌黏附素合成相關(guān)的表面蛋白P1和P1樣蛋白，與產(chǎn)酸性相關(guān)的乳酸脫氫酶，與耐酸能性相關(guān)的ropA、brpA等毒力因子均是變異鏈球菌致齲性的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。因此，如何通過(guò)降低這些毒力因子表達(dá)，進(jìn)而抑制變異鏈球菌過(guò)度生長(zhǎng)，減少胞外多糖產(chǎn)生，抑制生物膜形成及產(chǎn)酸耐酸能力，是防治齲病的有效措施。

眾所周知，在生物體傳遞遺傳信息的過(guò)程中，作為聯(lián)結(jié)核酸和蛋白質(zhì)的密碼子扮演著重要的角色。在遺傳密碼中，mRNA上3個(gè)相鄰的堿基組成一個(gè)密碼子，一個(gè)密碼子可編碼一種氨基酸。在生物體中有61種密碼子，20種氨基酸，這是由于遺傳密碼具有簡(jiǎn)并性，同一氨基酸對(duì)應(yīng)的多個(gè)密碼子被稱(chēng)為同義密碼子。但這些同義密碼子在翻譯的過(guò)程中使用的頻率并非一致，這種現(xiàn)象被稱(chēng)為“密碼子偏好性”。密碼子偏好性廣泛存在于不同生物中，是物種在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中受環(huán)境選擇、堿基突變、基因漂變等因素共同作用的結(jié)果，其還受到基因組大小、tRNA豐度和基因表達(dá)水平等的影響。密碼子偏好性對(duì)蛋白的表達(dá)有著直接的影響，能通過(guò)tRNA在翻譯水平上改變蛋白的翻譯速度。在同一生物中，攜帶同一種氨基酸的不同tRNA稱(chēng)為同功受體tRNA，tRNA的濃度通常與其讀取的密碼子的頻率正相關(guān)。在高度表達(dá)的基因中，編碼同種氨基酸的密碼子中往往有一個(gè)密碼子在頻率上占主導(dǎo)地位，并且該密碼子通常由最豐富的tRNA的同種受體讀取。因此，將宿主基因中不同頻率的同義密碼子進(jìn)行替換，將影響蛋白翻譯水平，進(jìn)而改變相關(guān)的表型。在齲病微生物研究中，尤其是變異鏈球菌的基因編輯中，該技術(shù)仍未見(jiàn)詳細(xì)報(bào)道。

目前，抑制變異鏈球菌毒力的方法大多是通過(guò)外源性地加入某些藥物和小分子化合物或通過(guò)引入拮抗菌，競(jìng)爭(zhēng)性地抑制變異鏈球菌活性。盡管這些方法能在一定程度上抑制變異鏈球菌毒力，但它們?nèi)杂幸恍┤秉c(diǎn)：(1)藥物篩選具有盲目性，不能高效準(zhǔn)確的找到特異性強(qiáng)的藥物，且具體作用成分難以確定；(2)某些小分子的提純或合成成本昂貴，步驟繁瑣；(3)藥物及化合物作用的具體機(jī)制大多尚不清楚，毒副作用也不明確；(4)某些拮抗菌是否對(duì)機(jī)體具有潛在毒性未見(jiàn)報(bào)道等。此外，也有利用傳統(tǒng)的基因敲除方法敲除毒力基因，從而達(dá)到抑制效果，但將目的基因敲除常常只是破壞部分外顯子而不是整個(gè)編碼區(qū)，殘留的編碼序列可能組合出新的未知的功能，給表型分析帶來(lái)麻煩；并且，對(duì)于某些必須基因，完整敲除后將造成細(xì)胞死亡，也就無(wú)法研究這些基因的功能。因此，綜合以上原因，亟需尋找一種新的策略來(lái)彌補(bǔ)當(dāng)前技術(shù)的不足。