[發明專利]一種TRV2病毒載體及其在突變基因文庫中的應用

有效

• 申請號: 202010217452.0
• 申請日: 2020-03-25
• 公開（公告）號: CN111334526B
• 公開（公告）日: 2022-09-30
• 發明（設計）人: 劉超超;王瓊
• 申請（專利權）人: 江蘇科技大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/54;C40B50/06;A01H5/00;A01H6/82
• 代理公司: 北京瑞盛銘杰知識產權代理事務所(普通合伙) 11617
• 代理人: 李績

1.一種TRV2病毒載體的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：(1)將SEQ ID NO.11所示序列插入到TRV2載體的多克隆位點EcoRI和BamHI之間，得到載體TRV2-GT2；

(2)以Gateway系統的載體pGWB419為模板，擴增得到自殺基因ccdB表達模塊，以同源重組方式將ccdB表達模塊插入到上述TRV2-GT2載體的BsaI位點處，得到載體TRV2-GT2-ccdB；所述擴增的引物包括ccdB-F5和ccdB-R5，其中ccdB-F5的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，ccdB-R5的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

2.權利要求1所述構建方法得到的TRV2病毒載體在構建番茄基因敲除文庫中的應用。

3.一種基于權利要求1所述構建方法構建得到的TRV2病毒載體的番茄基因敲除文庫的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：人工合成多條靶標gRNA，各靶標gRNA退火為雙鏈后，將全部靶標gRNA等摩爾量混合，形成靶標gRNA文庫，將此gRNA文庫與經過BsaI酶切過的TRV2-GT2-ccdB載體在T4 DNA連接酶體系中進行連接，連接產物轉化大腸桿菌DH5а,涂布LB平板后，收集LB平板的菌落，擴繁并提取質粒，最終獲得構建于TRV2載體的基因敲除文庫。

4.權利要求3所述構建方法得到的番茄基因敲除文庫在獲得突變番茄植株中的應用。

5.一種獲得突變番茄植株的方法，其特征在于，包括以下步驟：利用包含權利要求3所述構建方法構建得到的番茄基因敲除文庫的農桿菌侵染轉基因番茄植株的幼苗；

所述轉基因番茄植株的制備方法，包括以下步驟：(1)擴增番茄抗除草劑基因ALS1，利用點突變的方法將其編碼蛋白的第186位氨基酸Pro的編碼序列CCA突變為CT，得ALS1CCA→CT；編碼所述番茄抗除草劑蛋白ALS1的核苷酸序列為Solyc03g044330；

(2)將所述ALS1CCA→CT與Cas9基因共同構建于雙元載體pCAMBIA1300；

(3)將所述雙元載體pCAMBIA1300轉化至番茄中，得同時過量表達Cas9和ALS1CCA→CT的轉基因番茄植株。

6.根據權利要求5所述方法，其特征在于，步驟(1)所述點突變為修改1個堿基同時刪除一個堿基A，被刪除的堿基A位于一個PAM位點前方第四個堿基處。

7.根據權利要求5所述方法，其特征在于，步驟(2)所述雙元載體pCAMBIA1300中Cas9由擬南芥pAtUBQ啟動子驅動表達，ALS1CCA→CT由35S啟動子驅動表達。