[發明專利]人白介素2-紅色熒光蛋白在畢赤酵母中的重組表達及其體外緩釋促進T細胞增殖的應用

在審

• 申請號: 202010217384.8
• 申請日: 2020-03-25
• 公開（公告）號: CN111334546A
• 公開（公告）日: 2020-06-26
• 發明（設計）人: 劉冠楠;章文明;黃雨欣;陸然;劉穎;華芷鈺;倪怡靜;顧春陽;鄧哲文;鄧涵之;遲波
• 申請（專利權）人: 南京工業大學
• 主分類號: C12P21/02
• 分類號: C12P21/02;C07K19/00;C12N15/62;C12N15/81;C12N5/0783;A61K38/20;A61K9/06;A61K47/34;A61P35/00
• 代理公司: 江蘇圣典律師事務所 32237
• 代理人: 胡建華

本發明公開了人白介素2?紅色熒光蛋白在畢赤酵母中的重組表達及其體外緩釋促進T細胞增殖的應用，其包括如下步驟：將重組人白介素2?紅色熒光蛋白的畢赤酵母表達菌株的種子液接種到發酵培養基中發酵，當發酵液的OD₆₀₀值趨于穩定時，停止發酵，將發酵液純化處理后，即得到人白介素2?紅色熒光蛋白。與現有技術相比，本發明中以pGAP?KanR為組成型表達質粒，采用了以甘油為碳源的發酵培養基，實現了連續高密發酵，操作簡便，成本更低，解決了現有技術中發酵過程中需要額外添加物質進行誘導的缺陷。

技術領域

本發明屬于重組微生物及重組蛋白制備技術領域，具體涉及一種重組人白介素2-紅色熒光蛋白的畢赤酵母表達菌株的構建方法及其水凝膠體外緩釋的方法和在促進CD3+pan T細胞增殖中的應用。

背景技術

白介素2是一種由T淋巴細胞產生的細胞因子，作為免疫系統的一部分，具有刺激T淋巴細胞和B淋巴細胞生長并促進其活化的功能。2014年，Steven A.Rosenberg使用白介素2來治愈黑色素瘤病人，在細胞免疫治療領域進行探索和嘗試。目前，白介素2已被應用于黑色素瘤、腎癌等的臨床治療，并取得較好的治療效果。此外，據報道人白介素2長期培養T細胞可以促進終末分化；用白介素2短期培養的T細胞回輸到患者體內可產生明顯的抗腫瘤效果。現有專利中的白介素2多以大腸桿菌為表達宿主進行生產，但大多以包涵體的形式存在于細胞內，必須經過細胞破碎、雜蛋白去除、包涵體復性及純化標簽去除等系列步驟，才能獲得高質量產品，提高了生產成本，不利于大規模工業化生產。并且工程化大腸桿菌在長期的生產過程中會出現質粒丟失的現象，一定程度上影響了產量。而畢赤酵母作為一種甲基營養型酵母，有較完善的外源基因表達系統，具有易于高密度發酵，表達基因穩定整合在宿主基因組中，能使產物有效分泌并適當糖基化，培養方便經濟等特點。其遺傳背景清晰，分子操作手段成熟，已經實現了HBsAg、TNF、EGF、破傷風毒素C片段等多種外源基因的表達。其中AOX1與GAP是酵母表達中使用最多的啟動子，但使用AOX1需要甲醇誘導。甲醇運輸與存儲存在危險，監控困難，且甲醇有可能污染蛋白產品，因此有必要將畢赤酵母的AOX1甲醇啟動子替換為組成型GAP甘油啟動子，既可實現分批發酵，避免了危險品甲醇的使用，又降低了成本。

然而，白介素2作用半衰期短且在較大劑量下具有急毒性，應用和療效均受到一定程度的限制。目前主要通過增加給藥次數和劑量，來維持白介素2在治療部位的濃度。這無疑會在一定程度上增加治療費用、加劇患者的生理負擔。而水凝膠作為一種藥物緩釋載體，由于其良好的生物相容性，持續時間長、靶向能力強等特點而受被廣泛應用，已被FDA批準適用于特定醫學應用。而γ-聚谷氨酸水凝膠作為一種氨基酸類的性能優異的包裹材料，制備過程溫和，不會造成蛋白類藥物活性大幅降低，在體內不會引發劇烈的排異反應，并可以長期釋放藥物，最終被機體吸收。利用水凝膠包裹白介素2，根據臨床所需藥物濃度，控制水凝膠性能參數，減少注射給藥次數，實現藥物緩釋。同時在有害的環境(如胃里的酶或者低pH環境)中，水凝膠可以保護蛋白質不受損害，因此固定在水凝膠中的生物分子活性能夠保持較長的時間。利用水凝膠包裹白介素2，根據臨床所需藥物濃度，控制水凝膠性能參數，一次性注射給藥，實現藥物緩釋，且使用該緩釋方法產生的藥效理論上優于多次注射白介素2溶液。