[發(fā)明專利]卵巢濾泡膜干細(xì)胞及其分離方法、培養(yǎng)方法和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010214438.5
• 申請日: 2020-03-24
• 公開（公告）號: CN111593021B
• 公開（公告）日: 2023-08-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 項(xiàng)鵬;柯瓊;陳洪;李偉強(qiáng)
• 申請（專利權(quán)）人: 中山大學(xué)
• 主分類號: C12N5/074
• 分類號: C12N5/074;A61K35/545;A61P15/08
• 代理公司: 廣州新諾專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 44100
• 代理人: 羅毅萍

1.一種卵巢濾泡膜干細(xì)胞的分離方法，其特征在于，包括以下制備方法：

獲取卵巢組織：選擇年齡為4~10歲的雌性食蟹猴，獲取卵巢組織皮質(zhì)部，剝離卵巢組織周圍脂肪，保留卵巢皮質(zhì)基質(zhì)，清洗，將卵巢皮質(zhì)基質(zhì)剪成組織碎塊；

培養(yǎng)：向組織碎塊中加入培養(yǎng)液，離心，離心轉(zhuǎn)速為1400~1600rpm?，離心時(shí)間為4~6min，保留沉淀，加入培養(yǎng)液重懸，在37±0.5℃、5±0.5%?CO₂下孵育時(shí)間為20~30h，離心，離心轉(zhuǎn)速為1400~1600rpm，離心時(shí)間為4~6min，保留沉淀，加入培養(yǎng)液重懸，得到細(xì)胞懸液，接種培養(yǎng)，即得卵巢濾泡膜干細(xì)胞；所述培養(yǎng)步驟中的培養(yǎng)液DMEM-F12為基底液，包括以下濃度的成分：1nM地塞米松、1ng/ml?LIF、50ng/ml?胰島素、50ng/ml?轉(zhuǎn)鐵蛋白、50pg/ml亞硒酸鈉、20ng/ml?抑瘤素M、1%V/V非必需氨基酸、1%V/V?N2、2%?V/V?B27無血清添加劑、20ng/ml?bFGF、20ng/ml?EGF、20ng/ml?PDGF-BB、0.1mM?β-巰基乙醇。

2.一種卵巢濾泡膜干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟：

向由權(quán)利要求1所述分離方法得到的卵巢濾泡膜干細(xì)胞中加入培養(yǎng)液進(jìn)行傳代培養(yǎng)，所述培養(yǎng)液以DMEM-F12為基底液，包括以下濃度的成分：1nM地塞米松、1ng/ml?LIF、50ng/ml?胰島素、50ng/ml?轉(zhuǎn)鐵蛋白、50pg/ml亞硒酸鈉、20ng/ml?抑瘤素M、1%V/V非必需氨基酸、1%V/V?N2、2%?V/V?B27無血清添加劑、20ng/ml?bFGF、20ng/ml?EGF、20ng/ml?PDGF-BB、0.1mM?β-巰基乙醇。

3.一種卵巢濾泡膜干細(xì)胞的分化方法，其特征在于，包括以下步驟：

向由權(quán)利要求1所述分離方法得到的卵巢濾泡膜干細(xì)胞中加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行分化培養(yǎng)，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基以DMEM-F12為基底液，包括以下濃度的成分：2%V/V?FCS、1nM?T3、1ng/ml?LH、70ng/ml?IGF-1、10ng/ml?PDGF-BB、50ng/ml?胰島素、50ng/ml?轉(zhuǎn)鐵蛋白、50pg/ml亞硒酸鈉。