[發明專利]一種提高聚羥基丁酸乳酸酯中乳酸組分含量的基因工程大腸桿菌的構建方法及應用

在審

• 申請號: 202010214416.9
• 申請日: 2020-03-24
• 公開（公告）號: CN111363713A
• 公開（公告）日: 2020-07-03
• 發明（設計）人: 吳輝;魏香菊;吳櫸;郭鵬業
• 申請（專利權）人: 華東理工大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12P7/62;C12R1/19
• 代理公司: 上海三和萬國知識產權代理事務所(普通合伙) 31230
• 代理人: 任艷霞

本發明公開一種提高聚羥基丁酸乳酸酯中乳酸組分含量的基因工程大腸桿菌的構建方法及應用，改造途徑為構建由丙酮酸合成聚羥基丁酸乳酸酯代謝途徑，過表達2?羥基丙酰?CoA合成途徑中相關基因以增加LA?CoA的合成，改造途徑還包括削弱大腸桿菌內源性硫酯酶ydiI和yciA中的一種或兩種，以減少LA?CoA流向乳酸合成途徑。本發明將大腸桿菌體內的LA?CoA有效的流向目標產物的合成模塊，減少目標產物合成前體LA?CoA的浪費，通過對代謝途徑的分析和調控，利用基因工程手段對大腸桿菌進行改造，獲得的重組菌株產生的聚羥基脂肪酸酯中乳酸組分含量明顯增加。

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，更具體地講，涉及利用葡萄糖或木糖生產聚羥基丁酸乳酸酯的基因工程大腸桿菌菌株的構建方法及應用。

背景技術

目前，常用的塑料大多是由石油和天然氣等化石燃料合成的，導致了全球變暖及固體廢棄物積累等環境問題，這些問題催促我們開發利用可持續的原料生產生物基聚合物。聚羥基脂肪酸酯(Polyhydroxy alkanoates,PHA)是由微生物產生的一種聚酯，目前因其生物可降解性、光學性能和生物相容性等優良性質引起了研究者的廣泛關注。

聚乳酸是一種很有前景的生物質衍生聚合物，因為它可以替代石油基塑料，具有幾種理想的性質，如生物降解性，生物相容性和可堆肥性，聚乳酸本身無毒，但是傳統生化方法生產中的金屬催化劑殘留會影響其在醫學等方面的應用。可惜目前由于缺乏天然的乳酸聚合酶，無法實現在生物體內一步生產。 Seiichi Taguchi等利用底物相似性原則，通過對PHA合成酶進行突變成功地創造了微生物生物合成乳酸基聚酯的體系——聚3羥基丁酸乳酸酯P(3HB-co-L A)。

P(3HB-co-LA)是PHA家族的一種，該聚合物融合了單獨的聚乳酸透明且堅硬以及聚3-羥基丁酸不透明且易碎的特點，根據乳酸含量從而表現出不同的彈性和透明度。

P(3HB-co-LA)由經過突變的具有乳酸聚合活性的PHA合成酶催化3-羥基丁酰輔酶A(3HB-CoA)和2-羥基丙酰-CoA(乳酰輔酶A，LA-CoA)合成。為了進一步提高乳酸組分含量，研究者嘗試經過厭氧發酵使前體物質乳酸積累量增加，結果聚合物中乳酸的摩爾比大幅度增加到47mol％，但由于厭氧狀態對于細胞生長有一定的阻礙作用，使得聚合物干重有所下降，僅占菌體的2 wt％。Nduko等嘗試對碳源優化，以木糖作為碳源時，在改造后的大腸桿菌細胞合成的聚合物中，乳酸組分達到34mol％，相比于在葡萄糖中的26mol％有了較大幅度提升，當對PHA合成酶進一步優化后，乳酸組分再次提高到60 mol％。

日本科學家Seiichi Taguchi發現，在大腸桿菌中引入突變的PHA合成酶、丙酸輔酶A轉移酶、β酮硫解酶、乙酰乙酰輔酶A還原酶合成的P(3HB-co-LA) 中，乳酸組分含量都在70％以下，而同一套體系在谷氨酸棒桿菌中表達，產生的P(3HB-co-LA)中，乳酸組分含量在96.8-99.3％，進一步研究發現，谷氨酸棒桿菌體內的LA-CoA處于較高水平，幾乎和乙酰CoA同等濃度，但大腸桿菌體外的LA-CoA幾乎檢測不到。說明存在對LA-CoA有活性的降解酶，導致了 LA-CoA的降解，缺失這種降解酶將對提高P(3HB-co-LA)中的乳酸組分含量具有重要意義。但目前在大腸桿菌中，關于降解LA-CoA的酶沒有被報道。硫酯酶能水解化合物中羰基和硫原子之間的硫酯鍵的一大類酶，可以通過裂解酰基 CoA中間體中硫酯鍵形成游離的羧酸和CoA，由Tillander等科學家首次在大腸桿菌中檢測到。