[發明專利]一種適用于PCR擴增的真菌基因組DNA的提取方法

在審

• 申請號: 202010212861.1
• 申請日: 2020-03-24
• 公開（公告）號: CN111206072A
• 公開（公告）日: 2020-05-29
• 發明（設計）人: 閻香言;王志賢;盛長忠;周澤奇;粟艷
• 申請（專利權）人: 丹娜（天津）生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12N15/10
• 代理公司: 天津濱海科緯知識產權代理有限公司 12211
• 代理人: 耿樹志

1.一種適用于PCR擴增的真菌基因組DNA的提取方法，其特征在于：包括如下步驟：

S1、培養真菌，離心收集，得到菌體；

S2、向菌體中加入山梨醇buffer及破壁酶，充分混勻后孵育，離心收集得到菌體沉淀；

S3、向菌體沉淀中加入蛋白酶K及裂解液混勻，加入異丙醇及磁珠懸浮液后，再次振蕩混勻；

S4、將離心管放入金屬浴進行孵育，期間交替進行振蕩混勻和靜置；

S5、將孵育后離心管放置于磁力架靜置，磁珠吸附后，吸除液體；

S6、取下離心管，加入清洗液，振蕩混勻，然后將離心管放置于磁力架靜置，磁珠完全吸附后，吸除液體；

S7、取下離心管，加水，振蕩混勻，放入金屬浴孵育，期間顛倒混勻；

S8、將離心管放置于磁力架靜置，磁珠完全吸附后，將DNA溶液轉移到新離心管中，即得。

2.根據權利要求1所述的適用于PCR擴增的真菌基因組DNA的提取方法，其特征在于：所述步驟S3中裂解液的組成為：5mM乙二胺四乙酸、450mM三羧甲基氨基甲烷、450mM氯化鉀、300mM氫氧化鈉、8mM二硫蘇糖醇、1％曲通、0.03％N-月桂酰肌氨酸鈉。

3.根據權利要求1所述的適用于PCR擴增的真菌基因組DNA的提取方法，其特征在于：所述步驟S3中異丙醇的加入量為350μL，磁珠懸浮液的加入量為20μL。

4.根據權利要求1所述的適用于PCR擴增的真菌基因組DNA的提取方法，其特征在于：所述步驟S3中蛋白酶K的加入量為20μL，裂解液的加入量為300μL。

5.根據權利要求1所述的適用于PCR擴增的真菌基因組DNA的提取方法，其特征在于：所述步驟S6中清洗液的組份為：0.3M PH值為4.0的氯化鉀溶液。

6.根據權利要求1所述的適用于PCR擴增的真菌基因組DNA的提取方法，其特征在于：所述步驟S1具體包括如下步驟：1a、使用液體培養基培養真菌，用時36-72小時；1b、取菌體于離心管中，然后以12000r/min的轉速離心10min，收集菌體。

7.根據權利要求1所述的適用于PCR擴增的真菌基因組DNA的提取方法，其特征在于：所述步驟S2具體包括如下步驟：向菌體中加入600μL山梨醇buffer，然后加入5μL濃度為10U/μL破壁酶Lyticase，破壁酶的活性為50U,充分混勻，30℃孵育30min，以1800r/min的轉速離心10min，棄上清，收集沉淀。

8.根據權利要求1所述的適用于PCR擴增的真菌基因組DNA的提取方法，其特征在于：所述步驟S4具體包括如下步驟：將離心管置于金屬浴中65℃孵育15min，期間顛倒混勻3回，每回4-6次；室溫放置5min；振蕩混勻1min，共靜置9min，每3min振蕩混勻1min。

9.根據權利要求1所述的適用于PCR擴增的真菌基因組DNA的提取方法，其特征在于：所述步驟S7具體包括如下步驟：取下離心管，加入100μL水，振蕩混勻；放入56℃金屬浴孵育10min，期間顛倒混勻3回，每回4-6次。

10.根據權利要求1所述的適用于PCR擴增的真菌基因組DNA的提取方法，其特征在于：所述真菌為曲霉屬真菌，在步驟S1和S2之間還包括如下步驟：

(1)將菌體置于離心管中，用冷去離子水清洗3遍；然后將菌體移于50mL離心管中使其懸浮于濃度為0.2mol/L、pH值為8.0的25mL磷酸緩沖液中；

(2)離心收集到離心管中，加入500μL磷酸緩沖液，再加8g氧化鋯珠(直徑3mm)及0.3g氧化鋯珠(直徑0.2mm)，配平后放入組織破壁儀，設置研磨條件為：1800r/min，研磨時間99s，間隔時間10s，6個循環，一鍵自動研磨；然后將菌液及氧化鋯珠等分開，留菌液。