[發明專利]一種塞內卡病毒重組核酸、重組疫苗株及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 202010212460.6
• 申請日: 2020-03-24
• 公開（公告）號: CN111394367B
• 公開（公告）日: 2021-05-14
• 發明（設計）人: 鄭海學;楊帆;朱紫祥;曹偉軍;田宏;張克山;魏婷;鄭敏;張偉;黨文;馬旭升;李丹;茹毅;何繼軍;郭建宏;劉湘濤
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蘭州獸醫研究所
• 主分類號: C12N15/41
• 分類號: C12N15/41;C12N7/01;C12N15/85;A61K39/125;A61P31/14
• 代理公司: 北京方圓嘉禾知識產權代理有限公司 11385
• 代理人: 朱玲艷

1.一種塞內卡病毒重組核酸，其特征在于，所述重組核酸的序列為對塞內卡病毒株的5'UTR基因序列進行缺失突變改造后得到的病毒基因組序列；

對塞內卡病毒株的5'UTR基因序列進行缺失突變改造后的5'UTR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述塞內卡病毒株為SVV/FJ/001株。

2.權利要求1所述重組核酸在制備塞內卡病毒重組核酸或塞內卡重組疫苗株中的應用。

3.一種包含權利要求1所述的重組核酸的塞內卡重組病毒。

4.一種由權利要求1所述的重組核酸編碼的塞內卡重組病毒。

5.一種包含權利要求3或4所述的塞內卡重組病毒的塞內卡重組疫苗株。

6.根據權利要求5所述的塞內卡重組疫苗株，其特征在于，所述塞內卡重組疫苗株對塞內卡病毒分離株的半數免疫保護劑量的值均大于6。

7.權利要求3或4所述的塞內卡重組病毒的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：

（1）以SVV/FJ/001株的cDNA為模板，利用特異性引物對分別擴增得到SVV/FJ/001株的S1片段和S2片段；擴增所述S1片段的特異性引物對包括上游引物和下游引物SVA-1R，所述上游引物包括SVA-1F0和 SVA-1F；所述上游引物SVA-1F0的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述上游引物 SVA-1F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述下游引物SVA-1R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

擴增所述S2片段的特異性引物對包括上游引物SVA-2F和下游引物SVA-2R，所述上游引物SVA-2F的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述下游引物SVA-2R的核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示；

（2）將所述S1片段和S2片段分別與pMD20 T載體連接，得到亞克隆質粒PMD-S1和PMD-S2；

（3）以所述亞克隆質粒PMD-S1為模板，用突變引物SVA-m5UTRF和SVA-m5UTRR進行擴增，得到亞克隆質粒PMD-mS1，所述SVA-m5UTRF的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述SVA-m5UTRR的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；

（4）將質粒PMD-mS1用PacI和SphI雙酶切、質粒PMD-S2用SphI和NotI雙酶切后，回收基因片段，連接替換插入到經PacI和NotI雙酶切后的真核轉錄質粒prO/CHA/99中，得到所述重組質粒prSVV/FJ-M；

（5）將得到的真核轉錄質粒prSVV/FJ-M轉染塞內卡病毒敏感細胞，獲得塞內卡重組病毒。

8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，步驟（5）所述塞內卡病毒敏感細胞包括BHK-21細胞、PK-15細胞、ST細胞、SK-RST細胞、IBRS-2細胞、H1299細胞或293T細胞。

9.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，在步驟（5）獲得的所述塞內卡重組病毒，適用于懸浮細胞培養。

10.權利要求3或4所述塞內卡重組病毒或利用權利要求7~9任一 所述方法制備得到的塞內卡重組病毒在制備塞內卡重組疫苗中的應用。

11.一種塞內卡重組疫苗的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

1）將權利要求3或4所述塞內卡重組病毒接種至易感細胞內進行增殖培養，得到塞內卡重組病毒液；所述易感細胞包括BHK-21細胞、PK-15細胞、ST細胞、SK-RST細胞、IBRS-2細胞、H1299細胞或293T細胞的懸浮細胞；

2）對所述塞內卡重組病毒液中的塞內卡重組病毒進行滅活和乳化，得所述塞內卡重組疫苗。