[發(fā)明專利]一種利用自體免疫細(xì)胞定向分化為胰島細(xì)胞的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010212266.8
• 申請(qǐng)日: 2020-03-24
• 公開（公告）號(hào): CN111269875B
• 公開（公告）日: 2022-04-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉明錄;強(qiáng)邦明;韓慶梅;王立新;張傳鵬;金海鋒;盧永燦;馮建海;李希鵬
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東興瑞生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/071
• 分類號(hào): C12N5/071;C12N5/10
• 代理公司: 山東華君知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 37300
• 代理人: 武歡歡

1.一種利用自體免疫細(xì)胞定向分化為胰島細(xì)胞的方法，其特征在于：所述方法為從患者外周血獲取免疫細(xì)胞經(jīng)體外去分化為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，再定向分化生成胰島細(xì)胞；

所述定向分化生成胰島細(xì)胞，包括誘導(dǎo)多能干細(xì)胞定向分化誘導(dǎo)生成內(nèi)胚層細(xì)胞、誘導(dǎo)分化為原腸管細(xì)胞、誘導(dǎo)分化為胰腺祖細(xì)胞、誘導(dǎo)分化為胰腺內(nèi)皮層細(xì)胞、誘導(dǎo)分化為胰島細(xì)胞；

所述誘導(dǎo)多能干細(xì)胞定向分化誘導(dǎo)生成內(nèi)胚層細(xì)胞，用含CHIR99021化合物的S1培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)22-26h后，更換新鮮的S1培養(yǎng)基，培養(yǎng)48-70h獲得定型內(nèi)胚層細(xì)胞；

所述S1培養(yǎng)基為DMEM低糖培養(yǎng)基，另含有95-105ng/mL的Activin A，體積百分比為1-3%的B27；所述含CHIR99021化合物的S1培養(yǎng)基，CHIR99021化合物的濃度為13-15 ug/ml；

所述誘導(dǎo)分化為原腸管細(xì)胞，將內(nèi)胚層細(xì)胞使用S2培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)68-76h獲得原腸管細(xì)胞；所述S2培養(yǎng)基，為DMEM低糖培養(yǎng)基，另含有45-55ng/mL的KGF，體積百分比為1-3%的B27；

所述誘導(dǎo)分化為胰腺祖細(xì)胞，由原腸管細(xì)胞繼續(xù)誘導(dǎo)分化為胰腺祖細(xì)胞，分為兩個(gè)階段，第一階段為誘導(dǎo)早期胰腺祖細(xì)胞，先在含有190-210nM LDN193189的S3培養(yǎng)基培養(yǎng)22-26h，更換S3培養(yǎng)基培養(yǎng)24-48h；第二階段將早期胰腺祖細(xì)胞誘導(dǎo)成為胰腺祖細(xì)胞，使用S4培養(yǎng)基，培養(yǎng)4-6天；

所述S3培養(yǎng)基為DMEM/F12培養(yǎng)基，另含有45-55ng/mL的KGF、0.24-0.26uM的SANT1、490-510nM的PdbU、9.5-10.5uM的Y27632、1.9-2.1uM的RA、體積百分比為1-3%的B27；

所述S4培養(yǎng)基為DMEM/F12培養(yǎng)基，另含有45-55ng/mL的KGF、0.24-0.26uM的SANT1、4.5-5.5ng/ml的Activin A、9.5-10.5uM的Y27632、95-105nM的RA、體積百分比為1-3%的B27；

所述誘導(dǎo)分化為胰腺內(nèi)皮層細(xì)胞，將胰腺祖細(xì)胞，在S5培養(yǎng)基中培養(yǎng)4-5天，誘導(dǎo)分化為胰腺內(nèi)皮層細(xì)胞；所述S5培養(yǎng)基為DMEM高糖培養(yǎng)基，另含有0.24-0.26uM的SANT1、95-105nM的RA、0.95-1.05uM的XXI、9.5-10.5uM的SB431542、0.9-1.1uM的T3、19-21ng/mL的Betacellulin、體積百分比為1-3%的B27；

所述誘導(dǎo)分化為胰島細(xì)胞，使用的培養(yǎng)基為包含9.5-10.5uM 的SB431542和0.9-1.1uM的T3的CMRL1066培養(yǎng)基，培養(yǎng)4-7天。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用自體免疫細(xì)胞定向分化為胰島細(xì)胞的方法，其特征在于：所述誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，純度≧95%。