[發(fā)明專利]一種提高手性胺轉(zhuǎn)化率的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010209530.2
• 申請日: 2020-03-23
• 公開（公告）號: CN111454971B
• 公開（公告）日: 2022-11-11
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 宋浩;趙妍淑;張金華
• 申請（專利權(quán)）人: 天津大學(xué)
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N15/70;C12N1/21;C12P13/00
• 代理公司: 天津市北洋有限責(zé)任專利代理事務(wù)所 12201
• 代理人: 陸藝

本發(fā)明公開了一種提高手性胺轉(zhuǎn)化率的方法，包括：合成和擴(kuò)增含酶切位點(diǎn)的優(yōu)化后的ArR?ωTA核苷酸序列，構(gòu)建p2A4?ArR?ωTA、p2A4?FA和p2A4?ldh，F(xiàn)A為表達(dá)甲酸乙酰轉(zhuǎn)移酶的基因，分別導(dǎo)入大腸桿菌，得到重組菌1、FA和6；發(fā)酵，得到重組菌1、FA和6發(fā)酵液；離心，得到重組菌1、FA和6發(fā)酵液沉淀；分別制成FA粗酶液和ldh粗酶液；將重組菌1發(fā)酵液沉淀用PBS重懸，加PLP、NAD⁺，反應(yīng)；再加FA粗酶液、ldh粗酶液、甲酸脫氫酶、D?丙氨酸、底物酮和CoA，加助溶劑，反應(yīng)，終止，萃取，干燥。本發(fā)明的方法去除副產(chǎn)物丙酮酸，提高手性胺的轉(zhuǎn)化率。加甲酸脫氫酶回收輔因子還原型輔酶Ⅰ。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于化學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及一種提高手性胺轉(zhuǎn)化率的方法。

背景技術(shù)

近年來，對映體純胺在化學(xué)、制藥和農(nóng)用化學(xué)工業(yè)中起著至關(guān)重要的作用。手性胺被廣泛用于治療藥物，例如神經(jīng)科藥物，心血管藥物，降壓藥，抗感染藥和疫苗。目前，化學(xué)法、生物拆分法和生物不對稱合成法是制備手性胺的主要方法。不對稱合成法因其對環(huán)境的污染小，理論收率可達(dá)100％而成為研究的熱點(diǎn)。在利用轉(zhuǎn)氨酶不對稱合成手性胺過程中，轉(zhuǎn)氨反應(yīng)為可逆反應(yīng)并且副產(chǎn)物丙酮酸會阻礙反應(yīng)往產(chǎn)生胺的方向進(jìn)行。目前主要利用乳酸脫氫酶和葡萄糖脫氫酶偶聯(lián)體系消除副產(chǎn)物丙酮酸的抑制作用并且使輔因子再生，從而提高手性胺的轉(zhuǎn)化率。在利用轉(zhuǎn)氨酶不對稱合成手性胺的反應(yīng)中，還沒有人通過甲酸乙酰轉(zhuǎn)移酶和乳酸脫氫酶偶聯(lián)體系來提高手性胺的轉(zhuǎn)化率報道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種提高手性胺轉(zhuǎn)化率的方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下：

一種提高手性胺轉(zhuǎn)化率的方法，包括如下步驟：

(1)基因的體外合成和擴(kuò)增：

從NCBI數(shù)據(jù)庫獲得來源于節(jié)桿菌屬的(R)-選擇型ω轉(zhuǎn)氨酶的氨基酸序列，所述(R)-選擇型ω轉(zhuǎn)氨酶簡稱：ArR-ωTA；所述ArR-ωTA的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述ArR-ωTA的氨基酸序列在JCAT網(wǎng)站，通過輸入：避免XbaI，NdeI，SpeI和HindIII限制性酶切位點(diǎn)為條件，得到優(yōu)化后的ArR-ωTA核苷酸序列；

在優(yōu)化后的ArR-ωTA核苷酸序列前、后分別加入XbaI限制性酶切位點(diǎn)和HindIII限制性酶切位點(diǎn)，得到含酶切位點(diǎn)的優(yōu)化后的ArR-ωTA核苷酸序列，所述含酶切位點(diǎn)的優(yōu)化后的ArR-ωTA核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

(2)將步驟(1)獲得的含酶切位點(diǎn)的優(yōu)化后的ArR-ωTA核苷酸序列連接到p2A4載體中得到p2A4-ArR-ωTA；將表達(dá)甲酸乙酰轉(zhuǎn)移酶的核苷酸序列用FA表示，將FA連接到p2A4載體中，得到p2A4-FA；將ldh的核苷酸序列連接到p2A4載體中，得到p2A4-ldh；

所述p2A4載體的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示；

所述ldh的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；

(3)將p2A4-ArR-ωTA；p2A4-FA；p2A4-ldh分別導(dǎo)入大腸桿菌(E.coli MG1655)中，得到重組菌1，重組菌FA和重組菌6；

(4)將重組菌1、重組菌FA和重組菌6分別發(fā)酵，得到重組菌1發(fā)酵液、重組菌FA發(fā)酵液和重組菌6發(fā)酵液；

(5)分別將步驟(4)獲得的發(fā)酵液，離心收集沉淀，洗滌，得到重組菌1發(fā)酵液沉淀、重組菌FA發(fā)酵液沉淀和重組菌6發(fā)酵液沉淀；

(6)分別將步驟(5)獲得的重組菌FA發(fā)酵液沉淀和重組菌6發(fā)酵液沉淀分別用PBS重懸細(xì)胞并進(jìn)行超聲破碎處理；得到FA粗酶液和ldh粗酶液；