[發明專利]綠色熒光蛋白融合蛋白免疫親和柱的制備方法、免疫親和柱及其運用

在審

• 申請號: 202010199363.8
• 申請日: 2020-03-20
• 公開（公告）號: CN111521813A
• 公開（公告）日: 2020-08-11
• 發明（設計）人: 方衛斌;張海靈
• 申請（專利權）人: 天德瑞（北京）生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/577;G01N33/533;C07K14/435;C07K1/22;B01D15/42;B01D15/38;B01D15/10
• 代理公司: 北京集智東方知識產權代理有限公司 11578
• 代理人: 陳亞斌;關兆輝

1.一種綠色熒光蛋白融合蛋白免疫親和柱的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

S1、制備N個綠色熒光蛋白單克隆抗體，N為正整數；

S2、針對每一所述綠色熒光蛋白單克隆抗體制備與其對應的免疫親和柱，以獲得N個免疫親和柱；

以及S3、運用N個免疫親和柱中的一個或多個對同一綠色熒光蛋白融合蛋白進行純化，選取純化效果達到預期值的免疫親和柱作為目標綠色熒光蛋白融合蛋白免疫親和柱。

2.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟S1中包括：

S11、誘導綠色熒光蛋白表達，并對綠色熒光蛋白進行純化；

S12、建立綠色熒光蛋白單克隆抗體陽性雜交瘤細胞株，注射至實驗動物體內后收集腹水，且在純化腹水后獲得N個綠色熒光蛋白單克隆抗體。

3.如權利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述步驟S11包括：S111、將表達載體轉入宿主細胞內，通過化學方法和/或物理方法誘導綠色熒光蛋白表達；S112、對誘導表達的綠色熒光蛋白進行純化。

4.如權利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述步驟S12包括：S121、選取實驗動物，且將純化后的綠色熒光蛋白作為抗原分階段注射至實驗動物體內，以完成動物免疫，且在完成動物免疫后取實驗動物脾組織；

S122、用PEG將實驗動物脾細胞與骨髓瘤細胞進行融合，篩選出陽性融合細胞株，且在對陽性融合細胞株進行亞克隆后進行篩選，待亞克隆陽性率達到100％時建立綠色熒光蛋白單克隆抗體陽性雜交瘤細胞株；

S123、取實驗動物，且每只注射0.5ml石蠟油，7天后取綠色熒光蛋白單克隆抗體陽性雜交瘤細胞株細胞重懸于無血清培養基中，按1×10⁶個細胞/0.5ml/只的劑量注射至注射有石蠟油的實驗動物體內，注射7-14天后收集腹水；

S124、腹水進行離心去雜后過Protein G瓊脂糖凝膠柱，洗脫后中和至中性，濃縮后即獲得一個綠色熒光蛋白單克隆抗體；

以及S125、重復步驟S121-S124，直至獲得N個綠色熒光蛋白單克隆抗體。

5.如權利要求4所述的制備方法，其特征在于，步驟S121中，將純化后的綠色熒光蛋白作為抗原分階段注射至實驗動物體內，以完成動物免疫的步驟包括：

初免：按200μg抗原/只的劑量在實驗動物體內注射抗原溶液，此抗原溶液用同體積的弗式完全佐劑乳化；

二免：初免7-10天后，按100μg抗原/只的劑量在同一實驗動物體內注射抗原溶液，此抗原溶液用同體積的弗式不完全佐劑乳化；

三免：二免7-10天后，按100μg抗原/只的劑量在同一實驗動物體內注射抗原溶液，此抗原溶液用同體積的弗式不完全佐劑乳化。

6.如權利要求5所述的制備方法，其特征在于，步驟S121中，將純化后的綠色熒光蛋白作為抗原分階段注射至實驗動物體內，以完成動物免疫的步驟還包括：

四免：三免7-10天后，按100μg抗原/只的劑量在同一實驗動物體內注射抗原溶液，此抗原溶液用同體積的弗式不完全佐劑乳化。

7.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟S2包括：

S21、取Protein G磁珠，離心后去上清，PBS緩沖液洗2-3次后再用PBS溶液重懸，再加入層析柱中；

S22、待層析柱中的PBS緩沖液從底部出口流出后，在層析柱中加入0.5-1.5mg綠色熒光蛋白單克隆抗體，蓋上層析柱蓋子后于4℃搖床孵育過夜；

S23、過夜后用PBS緩沖液對綠色熒光蛋白單克隆抗體清洗2-3次，排出PBS緩沖液后再加入DMP溶液，20-25℃下孵育25-35min；

S24、排出DMP溶液后分別用0.2M三乙醇胺洗2-3次、50mM乙醇胺洗1-2次、1M甘氨酸溶液洗1-2次，以去除游離抗體；再用PBS緩沖液平衡層析柱后即獲得與一個綠色熒光蛋白單克隆抗體對應的免疫親和柱；

以及S25、重復步驟S21-S24，以獲得N個免疫親和柱。