[發明專利]一種分離和培養斑馬魚原代腸巨噬細胞的方法

有效

• 申請號: 202010197408.8
• 申請日: 2020-03-19
• 公開（公告）號: CN111411080B
• 公開（公告）日: 2022-08-09
• 發明（設計）人: 吳兵;顧緯卿;余靜;吳小梅
• 申請（專利權）人: 南京大學
• 主分類號: C12N5/0786
• 分類號: C12N5/0786
• 代理公司: 江蘇圣典律師事務所 32237
• 代理人: 徐芝強;胡建華

1.一種分離和培養斑馬魚原代腸巨噬細胞的方法，其特征在于，包括如下步驟：

（1）取健康斑馬魚置于消毒的培養水中暫養，然后轉移至含有青霉素和硫酸鏈霉素的消毒培養水中繼續暫養12~16 h；

（2）處死斑馬魚后，在酒精中浸泡30s以上，轉入無菌超凈操作臺，解剖斑馬魚，取出腸道在酒精中漂洗干凈；

（3）縱向劃開腸道，剪碎成1mm×1mm的組織小塊，在含有10vt% 胎牛血清的PBS溶液中清洗2遍以上；

（4）取步驟（3）得到的組織小塊在細胞篩網上進行研磨，研磨期間用含有10 vt %胎牛血清的RPMI 1640培養基沖洗，收集得到細胞濃度＞10⁸個/ml的細胞懸液；

（5）取一支無菌硅化離心管，依次加入魚臟器組織單核細胞分離液試劑盒中分離液Ⅰ和分離液Ⅱ，制成各液面分層清晰的具有梯度界面的雙層分離液；

（6）吸取步驟（4）得到的細胞懸液加于步驟（5）制得的雙層分離液液面上，用水平離心機離心，使得離心管中的溶液分層；

（7）吸取步驟（6）離心后分層溶液中環狀乳白色單核細胞層到另一離心管中，加入含有10 vt %胎牛血清的PBS溶液進行細胞清洗，清洗完成后，離心去除上清液；

（8）取含有10 vt %胎牛血清的RPMI 1640培養基重懸細胞，然后接種于25 cm²細胞培養瓶中，在28℃、5%CO₂培養箱中培養4h，通過差異貼壁法對腸巨噬細胞進行純化，培養4 h后棄去全部陳舊培養基，加入含有10 vt %胎牛血清的新鮮RPMI 1640培養基即得；

步驟（4）中，先將步驟（3）得到的組織小塊在70μm細胞篩網上使用塑料研磨杵研磨，所得細胞懸液用無菌巴氏吸管吹打后轉移至40μm細胞篩網上再使用塑料研磨杵研磨。

2.根據權利要求1所述的分離和培養斑馬魚原代腸巨噬細胞的方法，其特征在于，步驟（1）中，所述的消毒培養水中，青霉素的濃度為200~1000 IU/mL，硫酸鏈霉素的濃度為200~1000 μg /mL。

3.根據權利要求1所述的分離和培養斑馬魚原代腸巨噬細胞的方法，其特征在于，步驟（5）中，細胞懸液體積小于雙層分離液總體積的1/3。

4.根據權利要求1所述的分離和培養斑馬魚原代腸巨噬細胞的方法，其特征在于，步驟（6）中，所述水平離心機采用400-500g離心20-30min。

5.根據權利要求1所述的分離和培養斑馬魚原代腸巨噬細胞的方法，其特征在于，步驟（7）中，采用PBS溶液進行細胞清洗的次數為一次以上；每次清洗完成后，于1200-1500rpm離心6-10min，去除上清液。

6.根據權利要求1所述的分離和培養斑馬魚原代腸巨噬細胞的方法，其特征在于，步驟（8）中，重懸細胞時含有10 vt %胎牛血清的RPMI 1640培養基的用量為6ml。