[發明專利]一種用于對蝦的假型昆蟲桿狀病毒基因轉移系統、病毒及構建方法和應用

有效

• 申請號: 202010196617.0
• 申請日: 2020-03-19
• 公開（公告）號: CN111378689B
• 公開（公告）日: 2021-12-28
• 發明（設計）人: 郭華榮;毋夢茜
• 申請（專利權）人: 中國海洋大學
• 主分類號: C12N15/866
• 分類號: C12N15/866;C12N15/66;A01K67/033
• 代理公司: 北京方圓嘉禾知識產權代理有限公司 11385
• 代理人: 朱玲艷

本發明涉及一種用于對蝦的假型昆蟲桿狀病毒基因轉移系統、病毒及構建方法和應用，屬于基因工程技術領域。本發明所述用于對蝦的假型昆蟲桿狀病毒基因轉移系統，包括Bac?to?Bac昆蟲桿狀病毒表達系統、對蝦病毒囊膜蛋白基因表達質粒和昆蟲包裝細胞。本發明所述用于對蝦的假型昆蟲桿狀病毒基因轉移系統能夠在對蝦組織和細胞中穩定高效地轉移與表達外源基因。

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，具體涉及一種用于對蝦的假型昆蟲桿狀病毒基因轉移系統、病毒及構建方法和應用，即一種嗜對蝦的假型昆蟲桿狀病毒基因轉移系統、嗜對蝦的假型昆蟲桿狀病毒及構建方法和在對蝦成體組織與對蝦細胞(體外培養細胞)中的應用。

背景技術

Bac-to-Bac昆蟲桿狀病毒表達系統(Invitrogen產品)，已是一種很成熟的昆蟲細胞基因轉移技術。該系統由轉移質粒、輔助質粒、桿狀病毒Bacmid質粒以及感受態細胞DH10Bac組成，是基于大腸桿菌轉座酶Tn7的轉座原理，成功實現在大腸桿菌中快速將外源基因重組到桿狀病毒Bacmid質粒中，并擴增重組桿狀病毒的目的。其中，轉移質粒(pFASTBac1)的特點：在其昆蟲強啟動子PPH(多角體蛋白基因啟動子)及其之后的多克隆酶切位點的兩翼各插入轉座酶Tn7的左右識別位點Tn7L和Tn7R；桿狀病毒質粒(Bacmid)的特點：插入了原核細胞低拷貝質粒復制子(mini-F)、卡那霉素抗性基因以及插入了轉座酶識別位點attTn7的LacZ基因(不移碼插入)；輔助質粒為轉座酶表達質粒；宿主細胞DH10Bac是穩定轉化有輔助質粒和桿狀病毒質粒Bacmid的大腸桿菌感受態細胞。

該昆蟲桿狀病毒表達系統的技術流程為：首先將外源基因例如GUS(β-D-glucoronidase，β-D-葡萄糖苷酸酶)克隆到轉移質粒pFastBac1的多克隆酶切位點，純化出重組質粒pFastBac-GUS；然后將其轉化到大腸桿菌感受態細胞DH10Bac，然后在輔助質粒所表達的轉座酶的作用下，GUS基因被轉座到Bacmid質粒中的attTn7位點；提取和純化Bacmid-GUS重組質粒；將Bacmid-GUS重組質粒轉染包裝細胞sf9，包裝與純化Bacmid-GUS重組病毒；包裝病毒感染靶細胞，從而實現外源基因在靶細胞中的轉移與表達。

但已有研究表明，該昆蟲桿狀病毒表達系統不能有效侵染對蝦細胞，表明其在對蝦細胞中的親嗜性極低，不能應用于對蝦組織和細胞的基因轉移研究。

目前，在對蝦成體和體外培養細胞中尚缺乏一種高效的基因轉移與表達技術，嚴重阻礙轉基因對蝦和對蝦基因編輯研究的順利開展。

發明內容

本發明的目的在于提供一種用于對蝦的假型昆蟲桿狀病毒基因轉移系統、病毒及構建方法和應用。本發明所述用于對蝦的假型昆蟲桿狀病毒基因轉移系統能夠在對蝦組織和細胞中穩定高效地轉移與表達外源基因。

本發明提供了一種用于對蝦的假型昆蟲桿狀病毒基因轉移系統，所述基因轉移系統包括Bac-to-Bac昆蟲桿狀病毒表達系統、對蝦病毒囊膜蛋白基因表達質粒和昆蟲包裝細胞。

優選的是，所述對蝦病毒囊膜蛋白基因表達質粒包括對蝦白斑綜合癥病毒囊膜蛋白基因表達質粒。

優選的是，所述對蝦病毒囊膜蛋白基因表達質粒中所述囊膜蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

優選的是，所述對蝦病毒囊膜蛋白基因表達質粒的構建用骨架載體包括pcDNA3.1。

本發明還提供了基于上述技術方案所述基因轉移系統的用于對蝦的假型昆蟲桿狀病毒的構建方法，包括以下步驟：

1)利用Bac-to-Bac昆蟲桿狀病毒表達系統構建得到含外源基因的昆蟲桿狀病毒重組質粒；

2)將步驟1)得到的昆蟲桿狀病毒重組質粒和對蝦病毒囊膜蛋白基因表達質粒共轉染昆蟲包裝細胞，得到用于對蝦的假型昆蟲桿狀病毒。