[發明專利]一種可溶性高效表達的rChGM-CSF-IFNα融合蛋白及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 202010195228.6
• 申請日: 2020-03-19
• 公開（公告）號: CN111303302A
• 公開（公告）日: 2020-06-19
• 發明（設計）人: 王明麗;何志遠;趙俊;張俊玲
• 申請（專利權）人: 蕪湖天明生物技術有限公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/70;A61K38/21;A61K47/64;A61P31/04
• 代理公司: 安徽合肥華信知識產權代理有限公司 34112
• 代理人: 余成俊

本發明公開了一種可溶性高效表達的rChGM?CSF?IFNα融合蛋白及其制備方法和應用，其制備方法包括以下步驟：（1）分別提取擴增雞GM?CSF和雞IFN?α基因；（2）將擴增后的雞GM?CSF和雞IFN?α基因連接，得到融合蛋白基因；（3）構建重組克隆載體和重組表達載體，篩選得到基因工程菌；（4）融合蛋白的可溶性高效表達；（5）融合蛋白純化。本發明通過ChGM?CSF?IFNα融合表達，提高了單純ChIFNα的抗病毒活性，且延長了單純ChIFNα在體內的藥物半衰期，且通過ChGM?CSF?IFNα原核可溶性高效表達，有效解決了雞GM?CSF和雞IFN在家禽養殖業的應用成本問題。

技術領域

本發明屬于生物基因工程技術領域，尤其涉及一種可溶性高效表達的rChGM-CSF-IFNα融合蛋白及其制備方法和應用。

背景技術

隨著近年來全球畜禽養殖業的迅猛發展，我國養雞業已由農村家庭副業發展成了一大社會產業。然而，雞的病毒性傳染病，如新城疫、傳染性法氏囊病、馬立克氏病、傳染性支氣管炎和禽流感等，每年都會在不同的季節暴發。雞群一旦感染發病，會造成雞的大面積死亡，給養殖業造成巨大經濟損失。目前雞類病毒性傳染病的防治主要采用疫苗免疫和藥物治療。由于疫苗免疫的血清型單一，而病毒的血清型復雜，毒株變異快，常導致疫苗免疫失敗。且很多病毒性疾病目前尚無疫苗可用，有些病毒如禽流感已直接危害到人類的健康。動物用抗病毒藥物種類則更加匱乏，臨床治療主要采用抗生素。但是近年來由于抗生素濫用，導致耐藥性菌株大量產生，并通過食物鏈傳染給人，給人類健康帶來更大的威脅。

IFN(干擾素)是一類病毒感染誘導機體產生具有廣譜抗病毒、抗腫瘤和具有免疫調節作用的蛋白質，1957年Issacs和Lindeman首先發現，它是一類多功能的細胞因子，與細胞受體結合后，可誘導機體產生多種特異性蛋白質和酶類，主要通過抑制病毒基因轉錄和降解病毒RNA來抑制病毒的繁殖。按照IFN的產生細胞、生化特征及在機體免疫方面所發揮作用的不同，分為α、β、γ三類。現已知，α型IFN在體內可有選擇性地作用于病毒等感染的細胞，通過抑制受染細胞內病毒蛋白質的合成，發揮廣譜和高效抗病毒作用。IFN-α主要具有抑制病毒復制、抗寄生蟲、抑制多種細胞增殖、激活免疫細胞的殺傷活性等生物學活性。

GM-CSF(粒細胞巨噬細胞集落刺激因子)是一種細胞因子，主要由淋巴細胞、內皮細胞、成纖維細胞、肥大細胞和巨噬細胞等產生，在體外可刺激中性粒細胞和巨噬細胞形成集落，并可促進早期巨核紅細胞、嗜酸性祖細胞的增殖和發育。1977年Burgess等首次從小鼠的肺細胞培養液中發現一種能促進粒細胞和巨噬細胞形成集落的細胞因子，并將其命名為粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)，該細胞因子在機體免疫反應中發揮著重要的作用，不僅能夠活化巨噬細胞、樹突狀細胞以及其他單核細胞，還能促進造血干細胞的增殖分化并在成熟時將其轉移至外周。

GM-CSF在機體免疫應答過程中發揮著重要的作用，并作為疫苗佐劑被廣泛使用。1993年Dranoff等首次使用GM-CSF作為抗腫瘤疫苗免疫效應增強劑。1999年SomasundaramC等首次將pGM-CSF作為偽狂犬病病毒(PRV)DNA疫苗佐劑，有效增強了疫苗的免疫效力。近些年來，又有研究報道了pGM-CSF在口蹄疫病毒(FD-MV)、豬圓環病毒2型(PCV-2)等疫苗中具有良好的增強免疫效應。

現已知，天然雞IFN-α、重組雞IFN-α及重組GM-CSF在體內的半衰期均較短，一般為3～5小時。這給臨床治療帶來了諸多不便，如治療次數的增加，相應的時間成本及經濟成本隨之增加，也影響療效并增大了機體不良反應發生的概率。聚乙二醇修飾的干擾素雖然能延長半衰期，但是聚乙二醇修飾的干擾素成本非常高，在家禽臨床治療上很難得到應用。