[發(fā)明專(zhuān)利]體外檢測(cè)DNASE1L3蛋白的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010195195.5
• 申請(qǐng)日: 2020-03-19
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111500683A
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-08-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王巖;劉新東
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 浙江帝格生物科技有限責(zé)任公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/682
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/682
• 代理公司: 北京清亦華知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11201
• 代理人: 肖陽(yáng)

發(fā)明提出一種體外檢測(cè)DNASE1L3蛋白的方法。該方法包括：將待測(cè)樣品與TaqMan雙鏈探針進(jìn)行孵育和熒光信號(hào)檢測(cè)；基于檢測(cè)結(jié)果，確定所述待測(cè)樣品中是否含具有酶活性的DNASE1L3蛋白。本申請(qǐng)的發(fā)明人巧妙利用了DNASE1L3可以降解雙鏈DNA的機(jī)理，并結(jié)合TaqMan技術(shù)，首次提出了一種體外檢測(cè)DNASE1L3蛋白的方法。該方法靈敏度高，彌補(bǔ)了現(xiàn)有技術(shù)體外快速檢測(cè)DNASE1L3蛋白的空白，實(shí)現(xiàn)了顯著的技術(shù)進(jìn)步。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物檢測(cè)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及體外檢測(cè)DNASE1L3蛋白的方法。

背景技術(shù)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)的一個(gè)重要特征是大量產(chǎn)生針對(duì)自體細(xì)胞核組分(核糖核蛋白、DNA等)的抗體。這些抗體的產(chǎn)生是由體內(nèi)過(guò)度活化的B細(xì)胞激發(fā)，然后經(jīng)過(guò)天然免疫系統(tǒng)進(jìn)一步增強(qiáng)。最終，這些抗體與核酸成分形成大的免疫復(fù)合物，沉淀在組織中，從而引發(fā)慢性炎癥，例如血管炎、腎小球腎炎。IgG抗體與雙鏈DNA的強(qiáng)結(jié)合是引起SLE嚴(yán)重臨床表現(xiàn)的重要原因。針對(duì)染色質(zhì)抗體的產(chǎn)生被認(rèn)為是SLE的普遍特征，可以成為診斷SLE的敏感標(biāo)記物。凋亡細(xì)胞產(chǎn)生的DNA在正常生理?xiàng)l件下可以被有效降解，并不會(huì)引發(fā)抗原反應(yīng)。但在SLE病人體內(nèi)，來(lái)源于凋亡細(xì)胞的DNA無(wú)法被清除，進(jìn)而引發(fā)持續(xù)的抗原刺激，誘導(dǎo)抗體的產(chǎn)生，引起發(fā)病。

病人檢測(cè)以及動(dòng)物模型研究顯示DNASE1L3的失活性突變或缺失能夠引發(fā)SLE。重建DNASE1L3的表達(dá)，可以有效清除血液中的DNA成分，緩解甚至消除SLE。

然而，目前尚無(wú)體外檢測(cè)DNASE1L3蛋白活性的方法。

發(fā)明內(nèi)容

本申請(qǐng)是基于發(fā)明人對(duì)以下事實(shí)和問(wèn)題的發(fā)現(xiàn)和認(rèn)識(shí)作出的：

TaqMan雙鏈探針是一種寡核苷酸探針，其5’末端攜帶熒光報(bào)告基團(tuán)，如FAM、TET、VIC、HEX、Cy3、Cy5等，3’端攜帶熒光淬滅基團(tuán)，如Dabcyl、TAMRA、BHQ1等。探針完整時(shí)，熒光報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被熒光淬滅基團(tuán)吸收；探針被破壞后，使熒光報(bào)告基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)。

基于DNASE1L3可以降解雙鏈DNA的機(jī)理，本申請(qǐng)的發(fā)明人采用純化的DNASE1L3與TaqMan探針在熒光定量PCR儀器中進(jìn)行孵育，隨著完整的探針被DNASE1L3的降解，相互作用的熒光淬滅基團(tuán)(B)與熒光報(bào)告基團(tuán)(F)被分開(kāi)，使得熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光可以被熒光定量PCR儀檢測(cè)到，進(jìn)而可以檢測(cè)到DNASE1L3蛋白的活性。原理可參考圖1。

為此，本發(fā)明提出一種體外檢測(cè)DNASE1L3蛋白的方法，所述方法用于非診斷目的。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述方法包括：將待測(cè)樣品與TaqMan雙鏈探針進(jìn)行孵育和熒光信號(hào)檢測(cè)；基于檢測(cè)結(jié)果，確定所述待測(cè)樣品中是否含具有酶活性的DNASE1L3蛋白。本申請(qǐng)的發(fā)明人巧妙利用了DNASE1L3可以降解雙鏈DNA的機(jī)理，并結(jié)合TaqMan技術(shù)，首次提出了一種體外檢測(cè)DNASE1L3蛋白的方法。該方法靈敏度高，彌補(bǔ)了現(xiàn)有技術(shù)體外快速檢測(cè)DNASE1L3蛋白的空白，實(shí)現(xiàn)了顯著的技術(shù)進(jìn)步，推動(dòng)了科研工作的進(jìn)展。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述TaqMan雙鏈探針的正向探針具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；所述TaqMan雙鏈探針的反向探針具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，所述正向探針的5’端連接有熒光報(bào)告基團(tuán)，所述正向探針的3’端連接有熒光淬滅基團(tuán)。

AAAGGGAAAGGGAAAGGGAAAGGGAAAGGGAAAGGGAA(SEQ ID NO:1)。

TTCCCTTTCCCTTTCCCTTTCCCTTTCCCTTTCCCTTT(SEQ ID NO:2)。