[發(fā)明專利]轉(zhuǎn)基因玉米ZTAO5-1外源插入旁側(cè)序列及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010193868.3
• 申請日: 2020-03-19
• 公開（公告）號: CN111334506A
• 公開（公告）日: 2020-06-26
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張?zhí)m;王磊;姚興蘭;羅彥忠
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/6895
• 代理公司: 北京成實知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11724
• 代理人: 葉立濤

本發(fā)明公開了一種轉(zhuǎn)基因玉米ZTAO5?1外源插入旁側(cè)序列及其應(yīng)用。所述旁側(cè)序列的核苷酸序列分別如序列表SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。本發(fā)明還提供了用于檢測該旁側(cè)序列的引物對，引物序列分別如SEQ ID No：4?5和SEQ ID No：6?7所示的核苷酸序列。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因玉米ZTAO5?1外源插入片段旁側(cè)序列的鑒定適用于對轉(zhuǎn)基因玉米ZTAO5?1包括親本、雜種F1和后代，及其植株、組織、種子及其制品的檢測。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物基因技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種轉(zhuǎn)基因玉米ZTAO5-1外源插入旁側(cè)序列及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

玉米是重要的飼料原料，約占飼料組分的二分之一，玉米中維生素E含量相對較低，尤其是高活性的α-生育酚的含量很低，飼料中必須外源添加合成的DL-α-生育酚醋酸酯才能滿足動物的營養(yǎng)需求。但合成的DL-α-生育酚醋酸酯一方面是活性遠遠低于天然的維生素E，另一方面其在動物體內(nèi)的生物利用率也很低。因此，提高飼料原料-玉米中的維生素E含量將對飼料工業(yè)具有重要的意義。

另外，磷是動物生長、發(fā)育、繁殖所必需的重要礦物元素。植酸磷(六磷酸肌醇)，是谷物、豆類和油料等作物籽實中磷和肌醇的基本貯存形式，是動物飼料中的重要成分。但是由于單胃動物體內(nèi)缺乏能分解植酸的酶，導(dǎo)致以植酸磷形式存在的磷不能被直接利用，其利用率僅有0-40％，從而在飼養(yǎng)過程中造成了許多問題：一、磷源浪費。首先是飼料中磷源不能得到有效利用；其次，為了滿足動物對磷的需求，實際生產(chǎn)中要在飼料中額外添加無機磷，因此提高了飼料成本。二、形成的高磷糞便污染環(huán)境。飼料中85％左右的植酸磷不能被動物有效利用而直接排出體外，造成嚴重的土壤和水源磷污染，引發(fā)例如水環(huán)境的富營養(yǎng)和藻類過度生長等不良情況。三、植酸磷是抗營養(yǎng)因子，在動物胃腸道的消化吸收過程中與鈣及其它多種金屬離子、蛋白質(zhì)和一些營養(yǎng)物質(zhì)結(jié)合，形成不易被單胃動物吸收和利用的鏊合物，不但造成磷源浪費而且影響了這些營養(yǎng)物質(zhì)特別是鈣離子的吸收利用，不僅增加了飼料成本還降低了動物生產(chǎn)性能。因此，將植酸酶基因轉(zhuǎn)入飼料原料中，使得動物在消化過程中自動利用植酸酶將植酸磷降解成可利用的無機磷。因此，提高飼料原料-玉米中的植酸酶含量將對飼料工業(yè)具有重要的意義。

維生素E合成途徑中的關(guān)鍵酶基因γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶基因(ZmTMT)能將低活性的γ-生育酚轉(zhuǎn)化為高活性的α-生育酚；植酸酶基因(phyA2)能夠分解植酸為肌醇衍生物和無機磷。將ZmTMT基因和phyA2基因轉(zhuǎn)移到飼料用玉米品種中，并在玉米中高效表達，培育富含維生素E和植酸酶的玉米品種，可以大大提高植物中高活性的α-生育酚的含量以及植酸酶的含量；而且富含維生素E和植酸酶的轉(zhuǎn)基因玉米可直接應(yīng)用于動物飼料中，來滿足動物對維生素E和無機磷的需求，而無需在飼料中外源添加維生素E和磷酸氫鈣或添加通過發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)的植酸酶添加劑，大大降低了飼料的生產(chǎn)成本，還能緩解因動物不能利用有機磷產(chǎn)生高磷糞便造成的環(huán)境污染。

每一個轉(zhuǎn)基因事件都是唯一的，每一個轉(zhuǎn)基因事件所作出的轉(zhuǎn)基因品種都是唯一的，而轉(zhuǎn)基因食品又是關(guān)系國計民生的大事，其育種、售賣的過程中必須要經(jīng)過PCR驗證，在這個過程中必定會產(chǎn)生巨大的商機，對現(xiàn)有專利和其他文獻的檢索，尚未發(fā)現(xiàn)任何關(guān)于耐除草劑品質(zhì)性狀改良轉(zhuǎn)基因玉米事件ZTAO5-1外源插入載體旁側(cè)序列和利用此序列建立事件特異性定性、定量PCR檢測的報道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種轉(zhuǎn)基因玉米ZTAO5-1外源插入片段旁側(cè)序列及其應(yīng)用。

本發(fā)明另一目的在于提供一種轉(zhuǎn)基因玉米ZTAO5-1的PCR檢測方法及試劑盒。

本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因玉米ZTAO5-1培育方法包括如下步驟：將目的玉米基因組第8號染色體的第8179701353位，得到轉(zhuǎn)基因玉米；

所述外源DNA片段含有包括ZmTMT、phyA2和Bar三個基因的表達盒，10419bp；