[發(fā)明專利]一種細胞質與細胞核蛋白的提取試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010193340.6
• 申請日: 2020-03-18
• 公開（公告）號: CN112779210B
• 公開（公告）日: 2022-02-11
• 發(fā)明（設計）人: 劉銳;李靜怡;張濤;張舒羽;邵繼春;張博文
• 申請（專利權）人: 成都醫(yī)學院
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C07K1/14
• 代理公司: 成都高遠知識產權代理事務所(普通合伙) 51222
• 代理人: 李高峽;張娟

1.一種細胞質與細胞核蛋白的提取試劑盒，其特征在于：所述試劑盒由以下兩種試劑組成：

1)提取試劑A：含20mmol/L HEPES、10mmol/L KCl、2mmol/L MgCl₂、0.5％(體積比)NP-40、1mmol/LAEBSF、1mmol/L Na₃Vo₄、10mmol/L NaF、2μg/mL Aprotinin；提取試劑A的pH值為7.0-7.5；

2)提取試劑B：含20mmol/L HEPES、400mmol/L NaCl、1mmol/L EDTA、1mmol/L EGTA、1mmol/LAEBSF、20μmol/L Leupeptin、15μmol/L Pepstatin A、2μg/mL Aprotinin；提取試劑B的pH值為7.9-8.1；

其中，配制提取試劑A所用的HEPES的pH值是7.0；配制提取試劑B所用的HEPES的pH值是7.9，配制提取試劑B所用的EDTA的pH值是8.0，配制提取試劑B所用的EGTA的pH值是7.0。

2.如權利要求1所述的提取試劑盒，其特征在于：所述提取試劑A中所用的AEBSF、Na₃Vo₄、NaF、Aprotinin每次使用前加入；所述提取試劑B中所用的AEBSF、Leupeptin、Pepstatin A、Aprotinin每次使用前加入。

3.一種提取細胞質與細胞核蛋白的方法，其特征在于，它是使用權利要求1或2所述試劑盒進行提取的方法，包括如下步驟：

1)PBS洗滌細胞，富集細胞沉淀；

2)每2×10⁵-1×10⁶個細胞沉淀加入權利要求1或2所述試劑盒中的提取試劑A 100μL，移液器吹打混勻，冰浴10-20分鐘，2-8攝氏度下以4000-5000rpm轉速離心4-8min，得上清①和沉淀①；

3)將上清①在2-10攝氏度下以12000-14000rpm轉速離心18-25min，取上清，即為細胞質蛋白；

4)使用權利要求1或2所述試劑盒中的提取試劑A洗滌沉淀①3-5次，得細胞核沉淀；

5)向細胞核沉淀加入50uL權利要求1或2所述試劑盒中的提取試劑B，混勻，冰浴30-40min，冰浴期間每4-6min混勻一次；

6)在2-8攝氏度下以12000-14000rpm轉速離心10-15min，收集上清，即為細胞核蛋白。

4.如權利要求3所述的方法，其特征在于：步驟2)中冰浴時間為10min；

和/或，步驟2)中離心溫度為4攝氏度；

和/或，步驟2)中離心轉速為4500rpm；

和/或，步驟2)中離心時間為5min。

5.如權利要求3所述的方法，其特征在于：步驟3)中離心溫度為4攝氏度；

和/或，步驟3)中離心轉速為14000rpm；

和/或，步驟3)中離心時間為20min。

6.如權利要求3所述的方法，其特征在于：步驟4)中洗滌具體為： 向沉淀加入提取試劑A，移液器輕柔吹打，再在2-8攝氏度下以4000-5000rpm轉速離心4-8min。

7.如權利要求6所述的方法，其特征在于：步驟4)中洗滌具體為： 向沉淀加入提取試劑A，移液器輕柔吹打，再在4攝氏度下以4500rpm轉速離心5min。

8.如權利要求3所述的方法，其特征在于：步驟6)中離心溫度為4攝氏度；

和/或，步驟3)中離心轉速為14000rpm；

和/或，步驟3)中離心時間為10min。