[發明專利]一種基于三代測序的FMR1的檢測引物、體系及方法

在審

• 申請號: 202010192809.4
• 申請日: 2020-03-18
• 公開（公告）號: CN111197086A
• 公開（公告）日: 2020-05-26
• 發明（設計）人: 王樹偉;肖云平;史賢俊;趙仕蘭;洪強
• 申請（專利權）人: 上海歐易生物醫學科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12Q1/6869;C12N15/11
• 代理公司: 蘇州中合知識產權代理事務所(普通合伙) 32266
• 代理人: 劉召民

本發明涉及一種基于三代測序的FMR1的檢測引物、體系及方法，包括使用自主設計的引物進行擴增，加入擴增增強劑，選用特定的擴增條件等等。本發明降低了FMR1擴增的難度，可同時檢測基因型，三代測序檢測全長，CGG重復的檢出更精確。

技術領域

本發明屬于分子生物學領域，具體涉及一種基于三代測序的FMR1的檢測引物、體系及方法。

背景技術

脆性X綜合征(FXS)發生的分子機制為FMR1基因DNA層面CGG重復。該重復會引起FMR1表達缺乏，該基因編碼RNA結合蛋白脆性X蛋白(FMRP)，是負責智力遲滯的相關蛋白。該蛋白的缺乏會導致最常見的遺傳性智力低下疾病-脆性X綜合征。按正常人群中女性FMR1前突變攜帶率為1/130-1/256推算，中國目前有五百萬至一千萬女性潛在攜帶者。攜帶者有50％的幾率將FMR1突變基因遺傳給子女，子女存在著FMR1全突變而罹患脆性X綜合征的風險。其風險率與母親FMR1前突變CGG重復次數有關。重復次數越多其風險越高，按CGG的重復次數對個體進行分類，正常(5-54CGG重復)、前突變(55-200重復)或完全突變(200重復)，患病風險將從40％逐漸增加到100％。其中FMR1完全突變的男孩100％患病，女孩30％-40％患病。現在患者中發現的最多重復CGG序列230異常甲基化，導致FMR1基因轉錄沉默。其發病率僅次于先天愚型(21三體-唐氏綜合征)。患兒表現為重度智力殘疾，同時還伴有行為發育異常或容易患孤獨癥。

值得關注的是自發現脆性X綜合征近50年來，現代醫學一直無法進行有效而準確的產前篩查，導致大量的脆性X綜合征患兒降生。給社會及數量眾多的患兒家庭帶來了無法逆轉的痛苦和沉重的負擔。目前的醫學水平對此疾病尚無有效的治療方法，產前診斷和選擇性流產是唯一的預防手段。脆性X-FMR1基因現有的檢測技術為Amplide X檢測技術。該方法無法檢測基因型。傳統的檢測FMR1基因突變的方法有Southern雜交法和普通PCR法。Southern雜交法費時、費力、DNA需要量大、靈敏度低(5-10％)，無法確定CGG重復數；普通PCR方法成本低，但高GC的片段干擾了了FMR1的擴增。因為大量的CGG重復用二代測序拼接有困難，因此只能用三代或一代進行測序來進行檢測。

發明內容

為了克服現有技術存在的上述技術問題，本發明人在進行了大量的深入研究之后，提供了一種基于三代測序的FMR1的檢測引物、體系及方法。本發明提供的方法包括FMR1的引物設計，PCR擴增與三代測序結果分析。本發明通過設計高特異性的擴增引物，增加多種擴增增強劑，摸索擴增條件，調整擴增體系，采用三代的分析流程分析FMR1的CGG重復次數。

為了實現上述目的，本發明采用以下技術方案：

本發明提供了一種基于三代測序的FMR1的檢測引物，包括：

上游引物FMR1-F3：5'-gcagtcgaacatgtagctgactcaggtcacCCGCGGAATCCCAGAGAGGCC-3'，

下游引物FMR1-R3：5'-tggatcacttgtgcaagcatcacatcgtagGTCACTTAGCGCCGATTTCGGCC-3'。

本發明還提供了一種基于三代測序的FMR1的檢測體系，包括上述引物。

優選地，上述檢測體系還包括PCR擴增增強劑；更優選地，所述PCR擴增增強劑包括甘油及DMSO。

優選地，所述PCR擴增增強劑中，甘油的加入量為PCR擴增反應體系總體積的2.5％-5％，更優選5％，DMSO的加入量為PCR擴增反應體系總體積的2.5％-5％，更優選2.5％。

本發明還提供了一種基于三代測序的FMR1的檢測方法，包括如下具體步驟：

(1)根據人FMR1的DNA序列，跨CGG重復區設計PCR引物；