[發明專利]一種多重PCR_SNP基因分型檢測方法

在審

• 申請號: 202010191848.2
• 申請日: 2020-03-18
• 公開（公告）號: CN111235239A
• 公開（公告）日: 2020-06-05
• 發明（設計）人: 陳丹青
• 申請（專利權）人: 浙江大學醫學院附屬婦產科醫院
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858
• 代理公司: 重慶市信立達專利代理事務所(普通合伙) 50230
• 代理人: 陳炳萍

1.一種多重PCR_SNP基因分型檢測方法，其特征在于，所述多重PCR_SNP基因分型檢測方法PCR擴增時，引物的3`端堿基跟模板完全匹配時，DNA聚合酶進行延伸反應，檢測信號就強；如果引物的3`端堿基跟模板不匹配，檢測信號就弱；根據等位基因的基因型的不同設計不同的引物，將不同的等位基因區分開，在不同等位基因的引物5端各自連上一段不同的tag序列，序列能與芯片上點制的tag序列雜交，實現對基因型的判讀。

2.如權利要求1所述的多重PCR_SNP基因分型檢測方法，其特征在于，所述多重PCR_SNP基因分型檢測方法的四個SNP位點設計引物，并在上游引物的5`端分別連接Tag1/Tag2、Tag3/Tag4、Tag5/Tag6、Tag7/Tag8，同時用這四對Tag點制芯片，每個Tag重復點3個點，同時點上雜交陽性質控點PC 3個，雜交陰性質控點NC 3個，Blank點3個，Hex點3個。

3.如權利要求1所述的多重PCR_SNP基因分型檢測方法，其特征在于，所述多重PCR_SNP基因分型檢測方法包括設計待測SNP位點的PCR擴增引物及單堿基延伸引物。

4.如權利要求3所述的多重PCR_SNP基因分型檢測方法，其特征在于，所述多重PCR_SNP基因分型檢測方法包括提取血樣中的DNA，用分光光度計定量，瓊脂糖凝膠電泳質檢，質檢合格的DNA將濃度調整到50ηg/ul，-20℃儲存備用。

5.如權利要求4所述的多重PCR_SNP基因分型檢測方法，其特征在于，所述多重PCR_SNP基因分型檢測方法包括PCR擴增，采用多重PCR擴增技術，每個反應總體積5ul，包含模板DNA10ηg，HotstarTaq 0.5U，擴增引物每條0.5pmol，25mM dNTP，0.1ul，反應條件為94℃4分鐘；94℃20秒，56℃30秒，72℃1分鐘，45個循環；72℃3分鐘；4℃。

6.如權利要求5所述的多重PCR_SNP基因分型檢測方法，其特征在于，所述多重PCR_SNP基因分型檢測方法包括PCR產物純化，PCR反應產物使用0.5U SAP處理，去除體系中游離的dNTP，反應體系7μl，其中PCR產物5μl，SAP混合液2μl，SAP 0.5U,buffer 0.17μl，反應程序37℃20分鐘；85℃5分鐘；4℃。

7.如權利要求6所述的多重PCR_SNP基因分型檢測方法，其特征在于，所述多重PCR_SNP基因分型檢測方法包括單堿基延伸，總體積9μl反應體系包含SAP處理后PCR產物7μl，其中各延伸反應引物混合物0.804l,iPLEX酶0.041l,延伸混合物0.2μl，反應程序為94℃30秒；94℃5秒；52℃5秒，80℃5秒5個循環；返回94℃5秒，共40個循環；72℃3分鐘，4℃。

8.如權利要求7所述的多重PCR_SNP基因分型檢測方法，其特征在于，所述多重PCR_SNP基因分型檢測方法包括樹脂純化，每個延伸反應產物用6mg Clean Resin樹脂純化；

芯片點樣及質譜檢測，將純化產物移至384孔SpectroCHIP芯片上，上機測定，SpectroCHIP芯片使用MALDI-TOF基質輔助激光解吸附電離飛行時間質譜分析，檢測結果使用軟件分型并輸出結果。

9.如權利要求8所述的多重PCR_SNP基因分型檢測方法，其特征在于，所述多重PCR_SNP基因分型檢測方法包括：

(1)數據預處理，過濾掉在所有樣品中無信息量的位點及分型成功率小于90％的位點；過濾掉在對照樣品中MAF小于0.01的位點；用對照樣品，對每個SNP位點進行哈迪-溫伯格平衡檢驗；

(2)單點關聯分析方法，針對預處理后的每個位點，用卡方檢驗和Fisher精確檢驗方法對四種情況檢驗病例和對照間的差異，并對能計算比值比的情況，計算比值比及其95％置信區間。

10.如權利要求9所述的多重PCR_SNP基因分型檢測方法，其特征在于，所述多重PCR_SNP基因分型檢測方法包括四種情況：

(1)對等位基因頻率進行卡方檢驗和Fisher精確檢驗并計算OR值及95％置信區間；

(2)對基因型頻率進行卡方檢驗和Fisher精確檢驗；

(3)針對顯性模型對基因型頻率進行卡方檢驗和Fisher精確檢驗并計算OR值及95％置信區間；

(4)針對隱性模型對基因型頻率進行卡方檢驗和Fisher精確檢驗并計算OR值及95％置信區間。