[發明專利]一種擬南芥hsd1/2/3/4/5/6六突變體及其構建方法和應用

在審

• 申請號: 202010191616.7
• 申請日: 2020-03-18
• 公開（公告）號: CN111349651A
• 公開（公告）日: 2020-06-30
• 發明（設計）人: 邵群;馬長樂;王光祿;劉曉凡;楊賢鵬
• 申請（專利權）人: 山東師范大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H5/00;A01H6/20
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 宋海海

本發明提供一種擬南芥hsd1/2/3/4/5/6六突變體及其構建方法和應用，屬于基因編輯和分子育種技術領域。本發明根據HSD基因HSD2/3，HSD1/4/6在染色體上緊密連鎖的位置關系，利用CRISPR/Cas9技術及傳統的T?DNA插入、雜交技術相結合的方法可以在較短時間內達到精確、有效地敲除全部HSD基因的多突變體，為后續研究HSD基因家族的功能奠定堅實基礎。

技術領域

本發明屬于基因編輯和分子育種技術領域，具體涉及一種擬南芥hsd1/2/3/4/5/6六突變體及其構建方法和應用。

背景技術

公開該背景技術部分的信息僅僅旨在增加對本發明的總體背景的理解，而不必然被視為承認或以任何形式暗示該信息構成已經成為本領域一般技術人員所公知的現有技術。

油體是細胞中的貯油細胞器，其包含的三酰甘油等為種子萌發及植株早期生長提供重要的能源和碳源。羥化類固醇脫氫酶(hydroxysteroid dehydrogenase，HSD)是油體表面的固醇油質蛋白，對于調節生長發育、調控葉表皮蠟質合成及脂肪酸代謝、促進或調節BR的作用及鹽脅迫應答具有重要作用，但具體調控機制并不清楚。本方法以擬南芥的HSD基因家族為對象，利用CRISPR技術傳統的雜交方法相結合獲得敲除全部HSD基因的6突變體，為后續對HSD的功能進行深入研究奠定基礎，有重要的理論意義及實際應用價值。

目前最常用的研究基因功能的方法之一是敲除該基因，T-DNA插入植物基因組是獲得突變體的途徑之一，其整合的拷貝數較低，被插入的基因在后代中能夠穩定遺傳，但其插入位點是隨機的，不能精準突變某個目的基因。RNAi方法是敲除基因常用的技術，是指雙鏈RNA(double-stranded RNA，ds RNA)分子引起的序列特異性降解靶基因信使RNA(mRNA)，從而導致內源靶基因沉默。RNAi方法具有不完全敲除、臨時性且特異性差的特點，確定基因的精確功能比較困難，結果有限而且難以完全令人信服。而且對基因家族而言，敲除一個或幾個基因后，其他成員可能會補償其作用，所以把家族所有成員都敲除掉才有可能真正揭示其功能。

擬南芥HSD是一個大家族，包括8個成員，其基因組中有HSD1的5個同源基因HSD2、HSD3、HSD4、HSD5、HSD6，只敲除一個基因，難以弄清楚HSD家族各成員及整個基因家族的確切功能。然而迄今為止，研究僅限于AtHSD1，而且只進行了過量表達及RNAi突變株系的初步研究，結果證明AtHSD1對于調節植物生長發育具有重要作用，而且可能促進或調節BR的作用，對于提高油菜或其他農作物的生長及產量具有重要的潛在價值。由于RNAi方法的局限性，結果難以完全令人信服，RNAi突變株系中其他HSD基因的表達也未提供相關的數據。還有很多問題值得深入研究，如此酶的底物還沒找到，HSDs對于植物生長發育的調控機制還不清楚，HSDs在蠟質合成中的作用機制也不清楚，HSD與BR之間的關系也沒有清晰的線索。

擬南芥基因組中發現的6個HSD基因分別位于第Ⅲ、第Ⅳ及第Ⅴ染色體上，其中HSD2、HSD3在第Ⅲ染色體上緊密連鎖，HSD1、HSD4、HSD6在第Ⅴ染色體上緊密連鎖，得到單基因敲除的突變體相對容易，但由于缺乏有效可行的技術手段，利用RNAi、T-DNA插入技術及傳統雜交方法同時敲除緊密連鎖的HSD基因非常困難，敲除全部6個基因幾乎不可能，這也許是其他HSD成員及整個基因家族功能的研究還未見報道的主要原因。